免疫组化抗体选择要点

一抗的选择要点

1. 选择单克隆还是多克隆抗体？由一种B细胞产生的单一特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种B细胞产生抗体，形成抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小、检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱、抗体的亲和力强、灵敏度高，但易出现非特异性染色（实验时可以通过封闭等尽量避免非特异性染色）。

2. 抗体的种属来源。一般兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有例外。抗体的来源这点非常重要，后面检测时带标记的二抗必须与一抗来源相匹配。

3. 实验目的是检测什么种属的抗原，即Species Reactivity。这一点很重要，一般说明书上都有注明，如小鼠Mouse、大鼠Rat、人Human等等，选购时尽量选择说明书上已经标注反应性的抗体。

4. 能否做免疫组化？一般一抗说明书都会注明是否能做WB、IHC、ICC、IF等，建议最好选择注明的抗体，因为一般都是经过实验验证的。

5. 检测标本类型。用户是检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，都可以用来检测冰冻切片；但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。

6. 价格与质量。进口抗体时间长，且价格高，很多都是国内厂家OEM的，科研型的抗体属于浓缩型抗体，需要多摸索几次实验条件，建立合适的实验条件后再进行大批量的实验，并且实验操作者的熟练程度、对实验的把控等对实验结果影响也很大，实验细节一定要把控好。另外，抗体切记避免反复冻融。

二抗的选择

1. 种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（二抗来源goat or Rabbit均可）；如一抗是兔来源，那二抗就买抗兔的即可。

2. 标记物的选择。常见的标记物有HRP、Biotin、荧光素等。免疫组化现阶段多用二步法，二步法使用的二抗通常是带多聚HRP标记的，普通的HRP标记应用到免疫组化效果会比较差；前几年应用比较多的三步法，二抗上带Biotin标记，然后加入HRP标记的链霉素进一步反应。而免疫荧光染色就需要购买荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。如何选择二抗主要看实验应用是免疫组化还是免疫荧光。

3. 选择IgM还是IgG。二抗需与一抗的类别或亚型相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体

单克隆抗体的类别及亚型通常会在产品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗体。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚型（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚型的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。如果你不知道一抗是哪一类别或亚型，那么抗小鼠IgG是一个不错的选择，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

4. 生产厂家。Elabscience^®公司提供免疫组化染色试剂盒，内含 3% H₂O₂去离子水、 Polymer Helper （即用型）、polyperoxidase-anti-Mouse/Rabbit IgG（即用型），故试验中只需摸索一抗的浓度即可，3 mL包装的免疫组化试剂盒常规大约可以做60张切片。