Western Blot操作视频

本视频为Elabscience®公司蛋白免疫印迹的操作指南，对每一步的反应都做了演示，以便实验者能更好地理解WB实验的过程。

实验步骤：

1. 样品准备

裂解液（RIPA）准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液，现配现用。加入PMSF，加入原钒酸钠溶液。

组织样本-----黄豆大小组织剪碎，加入200-300 ul配备好的裂解液，冰上研磨，12000转离心5 min，取上清。

贴壁细胞-----6孔板一个孔长满，加150 ul配备好的裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打，吸取裂解好的样本，转入EP管，12000转离心5 min，取上清。

悬浮细胞-----细胞转入离心管，2000转离心5 min，弃上清，加入PBS清洗，2000转离心5 min，弃上清，每20 ul体系细胞加入150 ul裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打充分裂解，12000转离心5 min，取上清。

2. 蛋白浓度测定

标准曲线制备

待检样本上样

加入显色剂，室温避光20-30 min

酶标仪测定OD值

计算蛋白上样量（建议每样本上样总蛋白含量为50 μg）

3. 样本变性

每40 μL蛋白，加10 ul的5XSDS 上样缓冲液

沸水浴10 min

-20℃保存

4. SDS-PAGE胶制备

灌入分离胶

无水乙醇压平

分离胶完全聚合后，倒出无水乙醇

双蒸水冲洗

滤纸吸干

加入浓缩胶

插上梳齿

浓缩胶完全聚合后取出梳齿

5. 电泳

胶固定到电泳槽

倒入电泳液

加样，加marker,

电泳----80 V恒压至溴酚蓝到浓缩胶与分离胶交界处，改110 V恒压至溴酚蓝到凝胶底部

6. 电转移（湿转）

取出凝胶

切胶

蒸馏水冲洗

滤纸准备

PVDF膜准备，甲醇浸泡5 s

PVDF膜与滤纸一同浸泡于电转液中

按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好

电转

转膜时间

7. 封闭

取出转好的PVDF膜，滤纸吸干电转液

放入封闭器内，加5%的脱脂奶粉或5%的BSA

室温封闭2 h

8. 孵育一抗

取出封闭好的PVDF膜，滤纸吸干封闭液，

加稀释好的一抗,4℃孵育过夜

9. 洗脱

TBST冲洗两分钟，摇床漂洗3次，每次5 min

10. 孵育二抗

取出洗脱好的PVDF膜，滤纸吸干洗脱液

加稀释好的二抗, 室温摇床孵育2 h

11. 洗脱

TBST冲洗两分钟，摇床漂洗3次，每次5 min

12. 曝光

ECL底物1:1配比，现配现用

滤纸吸干PVDF膜

加入ECL底物

曝光

13. 数据分析

Bandscan软件分析条带