条件筛选(25)
流式TUNEL是检测细胞凋亡最常用的方法之一。在进行流式TUNEL实验时,可能会遇到染色结果异常的问题,包括凋亡诱导组未检测到凋亡细胞群、细胞碎片较多、正常组阳性率高等,本篇整理了流式TUNEL常见问题分析。
细胞凋亡早期的特征之一是磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl—serine,PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。而人膜联蛋白V(AnnexinV)对PS具有特异的亲和作用,将Annexin V进行荧光素——FITC标记,作为一敏感的探针可检测暴露在细胞膜表面的PS,利用流式细胞仪或者荧光显微镜观察细胞凋亡现象。 这种方法不需要固定细胞,避免了因固定造成的假阳性等问题,结果亦更可靠,这是目前公认的灵敏、高效和成熟的凋亡细胞检测方法之一。
坏死性凋亡(Necroptosis)是当细胞凋亡受阻时,通过细胞外信号(死亡受体-配体结合)或细胞内信号(外来微生物核酸)被激活的细胞自我破坏的过程。
线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件,发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体膜电位崩溃,细胞凋亡便不可逆转。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位∆Ψm的理想荧光探针,可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可检测到细胞膜电位的下降,可将JC-1荧光颜色的转变作为细胞凋亡早期的检测指标。
细胞发生凋亡时, 染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。
Elabscience®可提供5种荧光TUNEL试剂盒,选择合适的TUNEL荧光试剂盒分两步:1.确认荧光显微镜配置,2.确认实验样本是否带有荧光
泛凋亡(PANoptosis)是2019年由美国学者Malireddi等提出的一种全新程序性死亡方式。泛凋亡受到PANoptosome(泛凋亡体)复合物的调控,具有细胞焦亡(Pyroptosis)、凋亡(Apoptosis)和/或坏死性凋亡(Necroptosis)的关键特征。泛凋亡是一种复杂的细胞死亡方式。
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力,可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合,将Annexin V标记上荧光染料利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。本文主要介绍Annexin V实验的主要操作步骤及实验的一些注意事项。