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细胞内细胞因子染色步骤

细胞内细胞因子染色步骤

2018-08-01作者:admin赞:0

1.样本准备(详见流式细胞术样本制备技术


1) 收集细胞。经刺激和阻断处理的细胞(具体处理方案请参考文献进行),加细胞染色Buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液,调整细胞浓度约为1×107/ml。


2) 取100μl细胞/管(约1×106细胞),分别加到做好标记的流式管底部。


2.固定:

1) 如需要表面染色,则先依照“细胞表面染色步骤”选用适宜抗体进行表面染色。


2) 用100uL的1×细胞固定/破膜液(Fixation/Permeabilization buffer),将流式管中的细胞重悬,室温避光孵育30分钟。


3) 用300g离心5分钟,弃去上清。


3.破膜:


1) 用2mL的1×细胞破膜Buffer(Permeabilization Buffer)将固定过的细胞重悬,300g离心5分钟,弃去上清。


2)重复洗一次,300g离心5分钟,弃去上清。


3) 加入1ml的1×细胞破膜Buffer(Permeabilization Buffer),4℃避光孵育30分钟;300g离心5分钟,弃去上清。


4.胞内染色:


1)用100μl 的1×细胞破膜Buffer(Permeabilization Buffer)重悬细胞,加入相应的抗体,混匀,4℃避光孵育至少30分钟。


2)加入2ml的1×细胞破膜Buffer(Permeabilization Buffer)重悬细胞,300g离心5分钟,弃去上清。


3)加入2ml的1x细胞染色Buffer(或含0.1%BSA的PBS)悬起细胞,300g离心力离心5分钟,弃去上清。


4)加入0.5ml的1x细胞染色Buffer(或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞,用流式细胞仪进行检测和分析。



注意事项


1. 同一个细胞同时做细胞表面和细胞内的蛋白,建议先做细胞表面染色,再固定、破膜。


2. 细胞内染色推荐使用同型对照。



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