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流式细胞术样本制备技术

流式细胞术样本制备技术

2018-08-01作者:admin赞:13

单细胞是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。在应用流式细胞术中,制备出合格的分散单细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它既要求组织分散成为单个细胞,又要维持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。



流式细胞术样本制备的基本原则:

1).保证各种液体和悬浮细胞样本新鲜,尽快完成样本制备和检测;

2).针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或者EDTA处理,以清除杂质,使黏附的细胞彼此分离形成单细胞状态;

3).对新鲜实体瘤组织可选用酶消化法、机械打散法或化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液;

4).对石蜡包埋组织应先切成若干40-50μm厚的蜡片,经二甲苯脱蜡至水后,再用前述方法制备单细胞悬液;

5).单细胞悬液的细胞数不少于107/mL


流式细胞术实验操作大致分为以下五个步骤:

1).取材:取手术或活检组织必须具有代表性,如取手术肿瘤组织,必须取肿瘤细胞生长旺盛部位;组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜;一般在室温1个小时内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存;

2).对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色;

3).按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储;

4).依照软件提供的程序对检测结果进行定性定量分析;

5).检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。


1、 外周血液标本的制备

1)  常规血液样本制备

采集外周血,用肝素抗凝;采集后室温(25℃)保存,6h内处理;

•  红细胞裂解液(ACK buffer)取出后,恢复至室温待用;

•  流式管内加入200ul外周血后,加入3mLACK buffer,室温孵育3~5min

•  加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解;

•  300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重复洗涤一次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


2)  外周血单个核细胞样本制备

•  采集外周血2mL,用肝素抗凝,用生理盐水将血液稀释成4mL,混匀;

15mL的离心管内,先加入等体积(4mL)的淋巴细胞分离液;

•  将稀释后的外周血沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上,勿用力过大,以免造成血液与分离液混合。务必保持清晰的分层状态;

400g室温离心20-30min(根据血液样本量确定离心条件,建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果);离心后可见试管内血液清晰的分为4层,上层为血浆层,第二次为白色淋巴细胞层,第三层为透明分离液层,底层为红细胞层;

•  用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另1试管,用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)清洗2遍,每次300g离心5min;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


2、 骨髓细胞样本制备

1)  常规骨髓细胞样本制备

•  无菌抽取骨髓液0.5mL,用肝素抗凝;

•  红细胞裂解液(ACK buffer)取出后,恢复至室温待用;

•  骨髓液中加入3mLACK buffer,室温孵育3~5min

•  加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解;

•  300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重复洗涤一次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


2)  骨髓液单个核细胞样本制备

•  无菌抽取骨髓液0.5mL

•  将骨髓液标本中滴入含1000U/mL肝素抗凝剂的1mL PBS液中;

•  加入PBS稀释液将样本稀释至10mL

15mL的离心管内,先加入等体积(5mL)的淋巴细胞分离液;

• 用吸管吸取5mL的稀释后的骨髓液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液的液面上;

400g室温离心20-30min(根据骨髓样本量确定离心条件,建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果);离心后可见试管内骨髓液清晰的分为4层,上层为PBS稀释液层,第二层为白色淋巴细胞层,第三层为透明分离液层 ,第四层为红细胞层;

•  用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另1试管,用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)清洗2遍,每次300g离心5min;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


3、 体液、灌洗液或悬浮培养细胞的制备

•  采集新鲜体液、灌洗液或悬浮培养细胞;

300g离心5min,收集细胞沉淀;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

•  若悬液中有明显的沉淀块,需用200~300目的滤网过滤后再用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)洗涤1~2次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整浓度至1x107/mL备用。


4、 贴壁细胞的制备

•  吸除培养基上清液,用含无钙、镁离子的PBS漂洗一次;

•  以25mL培养基为例,加入1mL消化液(0.1%胰蛋白酶),置室温(25℃)或37℃消化2~5min;或者加入1mLEDTA0.02%,pH7.4)冰上静止5~10min

•  在倒置显微镜下观察,发现胞质回缩、间隙加大,立即吸除消化液并加入等倍体积含血清的培养基终止消化;

•  用吸管吸取瓶内液体,反复吹打瓶壁细胞。吹打动作要轻柔并尽量避免产生泡沫;

•  转移至离心管,300g离心5min,弃上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


5、 组织标本的制备

1) 剪碎研磨法:

•  将组织用PBS或无血清培养基漂洗干净;

•  将组织置于平皿中,用眼科剪剪成小颗粒(1~2mm3);

•  用注射器针芯研磨成匀浆;

•  滴加适量的PBS或无血清培养基,用移液器吹打混匀;

•  经200~300目滤网过滤,300g离心5min,弃上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


2)  网搓法

•  将300目尼龙网扎在小烧杯上;

•  把剪碎的组织放在网上,以眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边加PBS冲洗,直至将组织搓完;

•  收集细胞悬液,300g离心5min,弃上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


3)  研磨法

•  将组织剪成1~2mm3大小的组织块;

•  放入组织研磨器中,加入1~2mLPBS

•  转动研棒,研至匀浆;

•  加入10mLPBS,冲洗研磨器;

•  收集细胞悬液,经200~300目尼龙网过滤,300g离心沉淀5min,弃上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


注意:1)以上方法为机械法,用于处理部分软组织例如胸腺、淋巴结等,对硬组织或纤维组织效果不好,并且对组织细胞有一定的损伤。

2)若组织为脾脏,可用研磨法处理后做红细胞裂解。在300g离心沉淀5min弃上清后,加入3mLACK buffer,室温孵育3~5min;再加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解;后续操作同研磨法。


4) 胰蛋白酶消化法:

适用于消化间质较少的组织,如上皮、肝、肾等组织,由于钙离子或血清会抑制胰蛋白酶的消化作用,此过程中使用的液体应不含这些离子或血清。消化时间根据不同情况进行调整,温度低、组织块大、胰蛋白酶浓度低,消化时间长;反之则缩短消化时间。胰蛋白酶常与EDTA0.02%)等比例混合使用可提高消化效率。


•  将组织块用无钙、镁离子的PBS漂洗干净;

•  将组织置于平皿中,用眼科剪刀剪成小颗粒(1~2mm3);

•  加入30倍组织量的蛋白酶溶液(0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA等比混合);

•  移液管转至三角烧瓶,置于37℃水浴或者恒温箱中消化20~60min,每隔5~10min震荡一次。若需消化较长时间,可每隔15min2/3的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液,加入含血清培养基终止消化,另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化;

•  将消化液或分批收集的细胞悬液经200~300目的滤网过滤,300g离心5min,弃上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


5) 胶原蛋白酶消化法:

此法适用于分离纤维性组织、上皮及癌组织。钙、镁离子不会抑制消化作用,因此可用PBS或含血清培养基配制以提高细胞成活率。


•  将组织块用PBS漂洗干净;

•  将组织置于平皿中,用眼剪刀剪成小颗粒(1~2mm3);

•  加入30倍组织量的蛋白酶溶液(0.1~0.3μg/mL的胶原蛋白酶);

•  移液管转至三角烧瓶,置于37℃水浴或者恒温箱中消化4-48h,每隔5~10min震荡一次。亦可每隔15min2/3的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液,加入含血清培养基终止消化,另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化;

•  将消化液或分批收集的细胞悬液经200~300目的滤网过滤,300g离心5min,弃上清;

用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


注意以上几种为最常见的实体组织样本单细胞制备方法,机械法常常造成严重的细胞损伤,单细胞产量低;酶学法、化学法(酶和EDTA结合使用)对实体组织的分散解聚较理想,但对所测细胞化学成分可能存在不良影响,所以需结合实验目的选择合适的单细胞悬液制备方法。


6、 石蜡包埋组织的流式细胞样本制备:

外科手术获得的实体组织,大部分经过石蜡包埋处理。石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立,扩大了流式细胞术的应用范围。


•  将石蜡包埋组织切成40~50μm厚的组织切片3~5片,或者用乳钵研成0.5mm直径大小的颗粒,放入10mL的试管中;

•  加入5~8mL二甲苯,室温下脱蜡1~2天,视石蜡脱净与否,更换1~2次二甲苯,石蜡脱净后,弃去二甲苯;

•  水化:依次加入5mL 100%95%70%50%梯度乙醇,每次10min

•  去乙醇,加入蒸馏水3~5mL10min后弃之;

•  消化:可加入2mL0.5%胰蛋白酶(pH1.5~2.0)消化液,置于37℃恒温水浴中消化30min,在此期间,每隔10min用振荡器震荡1次;

•  消化30min后,加入含血清培养基终止消化;

•  经300目尼龙网过滤,未消化好的组织可进行第二次消化;

•  收集细胞悬液,300g离心5min,弃上清;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

•  用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。

注意事项:

Ø 新鲜组织标本应及时进行处理保存,以免组织在室温下放置时间过长,产生中心组织坏死或者细胞自融,影响FCM测定结果;

Ø  酶学法要注意条件的选择和影响因素,同时注意酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等方法对酶消化法的影响;

Ø  不同的实体组织应选取不同的制备方法,如富含细胞的组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等,用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞;

Ø  在使用酶学方法时,应重视酶的选择,如含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等,应选用胶原酶消化。



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