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细胞增殖和细胞毒性(CCK-8法)原理和经验总结

细胞增殖和细胞毒性(CCK-8法)原理和经验总结

2019-07-10作者:admin赞:2

一、实验原理:

细胞活力检测试剂盒(CCK-8) 可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度,无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。


二、用途:

药物筛选、

细胞增殖测定、

细胞毒性测定、

肿瘤药敏试验等。


三、优点:

· 使用方便,无需洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂;

· CCK-8法能快速检测;

· CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;

· CCK-8法的重复性优于MTT 法,产生的formazan 是水溶性的,减少因洗涤和溶解带来的误差;

· CCK-8法对细胞毒性小,可以多次测定选取最佳测定时间,与MTT 方法相比线性范围更宽,灵敏度更高;

· CCK-8细胞活性检测试剂无需预制,即开即用。


四、实验操作指南:

1. 96孔板每孔加入细胞100 μL(留2个空白组不加细胞,加入同体积的培养基)。细胞置于37°C的5%CO2细胞培养箱中培养24 h。

注:A、通常细胞增殖实验每孔加入100 μL约含2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100 μL约含5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。

B、培养温度与细胞类型有关,一般哺乳动物细胞建议37°C,其他种属根据细胞培养条件选择合适的温度。

2. 每孔加入10 μL不同浓度的药物刺激激(1 中加了细胞的,留 2 个对照组不加药物,加 入同体积的培养基)。

3. 将96孔板在37°C,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

注:同上。根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。

4. 每孔加入10 μL的CCK-8溶液。37°C,5%CO2培养箱中孵育1~4 h。

注:同上。根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。

5. 酶标仪测定450 nm处的吸光度。

6. 如果暂时不测定OD值,可向每孔中加入10 μl 0.1 M HCl溶液或者1%(W/V)SDS溶液,并遮盖培养板避光室温保存。在24小时内吸光度不会发生变化。

7. 结果分析:

A.细胞存活率:将各测试孔的OD值减去本底OD值(空白组),各重复孔的OD值取平均数±SD。

细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100%。

B.求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)。


五、经验总结:

1、种板数:通过文献确认,看实验所用细胞别人是否做过,找出大致范围。稀释一系列浓度种板。

观察多长时间细胞可贴壁完全,一般贴壁生长24小时。在实验时间内,观察不同细胞数下孔内生长情况。在拟定的时间内,细胞是刚好铺满还是堆积生长?

因为每块板都需设置对照孔,也就是含有细胞的培养基中加入CCK8,这个数值是板上的最大数值,CCK8试验最佳OD值在1.0附近。不要让细胞长满,其一,会对药物顺利进入细胞产生影响此,其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大。

2、贴壁生长的时间一般设置贴壁24h,这个时间一般细胞已经贴壁完全,且对安排实验时间也方便。

3、加药后的孵育时间,设置时间梯度,根据数据的稳定性(RSD)、OD值的范围(1.0左右)这些来选择最好的时间。

4、接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接种数孔即混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发,为了减少误差,建议培养板的四边每孔只加培养基或无菌PBS,而不作为指标检测孔。

5、CCK8试剂加入量,按照说明书的体系加入合适的CCK-8的含量如细胞体系较大,适当增加CCK-8的量。

6cck8试剂加入后孵育时间,随着时间的增加,OD值就会增大。CCK- 8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。第一次做实验时,建议先做数孔摸索接种细胞的最佳数量和加入CCK-8试剂后的最佳孵育时间。一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量 (~105个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞,在加入CCK- 8孵育1- 4小时后,可先从培养箱中取出,目测染色程度或用酶标仪测定决定CCK- 8最佳孵育时间。若显色困难,可将培养板放回培养箱,继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞,CCK- 8的孵育时间一般为1- 4小时,多数细胞在培养30分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应,培养3.5-4小时左右检测效果最佳总之原则就是把OD值控制在1.0左右。

7、实验时尽量多设置复孔,取平均值。实验时OD值控制在1.0左右。因人为造成的数据不稳定只能通过增大样品数,借助数据处理来弥补。另外实验操作一定要仔细小心,尽量平行操作。

8、 CCK-8的检测依赖于脱氢酶催化的反应,如果待检测体系中存在较多的还原剂,例如一些抗氧化剂会干扰检测,需设法去除。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。

9、 如何判定待测溶液是否有还原性?不含细胞的待测溶液孔中加入CCK-8溶液10μl,孵育1-4小时,测定在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小,说明待检测体系中存在较少的还原剂,正式检测时即可直接加入CCK-8 ;如果该吸光度相对较大,说明待检测体系中存在较多的还原剂,正式检测时则需要除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基和10 μl CCK-8进行检测。

10、 如果样品为高浑浊度的细胞悬液,建议设定600 nm (或600 nm以上) 作为参比波长,扣除参比波长的O.D值即可。


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