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Western Blot操作视频

本视频为Elabscience®公司蛋白免疫印迹的操作指南,对每一步的反应都做了演示,以便实验者能更好地理解WB实验的过程。

实验步骤:
1. 样品准备
裂解液(RIPA)准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液,现配现用。加入PMSF,加入原钒酸钠溶液。
组织样本-----黄豆大小组织剪碎,加入200-300 ul配备好的裂解液,冰上研磨,12000转离心5 min,取上清。
贴壁细胞-----6孔板一个孔长满,加150 ul配备好的裂解液,冰上裂解5-10 min,枪头吹打,吸取裂解好的样本,转入EP管,12000转离心5 min,取上清。
悬浮细胞-----细胞转入离心管,2000转离心5 min,弃上清,加入PBS清洗,2000转离心5 min,弃上清,每20 ul体系细胞加入150 ul裂解液,冰上裂解5-10 min,枪头吹打充分裂解,12000转离心5 min,取上清。

2. 蛋白浓度测定
标准曲线制备
待检样本上样
加入显色剂,室温避光20-30 min
酶标仪测定OD值
计算蛋白上样量(建议每样本上样总蛋白含量为50 μg)

3. 样本变性
每40 μL蛋白,加10 ul的5XSDS 上样缓冲液
沸水浴10 min
-20℃保存

4. SDS-PAGE胶制备
灌入分离胶
无水乙醇压平
分离胶完全聚合后,倒出无水乙醇
双蒸水冲洗
滤纸吸干
加入浓缩胶
插上梳齿
浓缩胶完全聚合后取出梳齿

5. 电泳
胶固定到电泳槽
倒入电泳液
加样,加marker,
电泳----80 V恒压至溴酚蓝到浓缩胶与分离胶交界处,改110 V恒压至溴酚蓝到凝胶底部

6. 电转移(湿转)
取出凝胶
切胶
蒸馏水冲洗
滤纸准备
PVDF膜准备,甲醇浸泡5 s
PVDF膜与滤纸一同浸泡于电转液中

按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好

电转

转膜时间


7. 封闭
取出转好的PVDF膜,滤纸吸干电转液
放入封闭器内,加5%的脱脂奶粉或5%的BSA
室温封闭2 h

8. 孵育一抗
取出封闭好的PVDF膜,滤纸吸干封闭液,
加稀释好的一抗,4℃孵育过夜

9. 洗脱
TBST冲洗两分钟,摇床漂洗3次,每次5 min

10. 孵育二抗
取出洗脱好的PVDF膜,滤纸吸干洗脱液
加稀释好的二抗, 室温摇床孵育2 h

11. 洗脱
TBST冲洗两分钟,摇床漂洗3次,每次5 min

12. 曝光
ECL底物1:1配比,现配现用
滤纸吸干PVDF膜
加入ECL底物
曝光

13. 数据分析
Bandscan软件分析条带