• 本公司产品仅供体外研究使用,不用于临床诊断

当前位置: 首页>>资源中心 >>实验操作视频 >>详细内容

实验操作视频

Western Blot操作视频

        本视频为Elabscience®公司蛋白免疫印迹的操作指南,对每一步的反应都做了演示,以便实验者能更好地理解WB实验的过程。

实验步骤:
1. 样品准备  
        裂解液(RIPA)准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液,现配现用。加入PMSF,加入原钒酸钠溶液。
        组织样本-----黄豆大小组织剪碎,加入200-300 ul配备好的裂解液,冰上研磨,12000转离心5 min,取上清。
        贴壁细胞-----6孔板一个孔长满,加150 ul配备好的裂解液,冰上裂解5-10 min,枪头吹打,吸取裂解好的样本,转入EP管,12000转离心5 min,取上清。
        悬浮细胞-----细胞转入离心管,2000转离心5 min,弃上清,加入PBS清洗,2000转离心5 min,弃上清,每20 ul体系细胞加入150 ul裂解液,冰上裂解5-10 min,枪头吹打充分裂解,12000转离心5 min,取上清。

2. 蛋白浓度测定  
        标准曲线制备  
        待检样本上样    
        加入显色剂,室温避光20-30 min  
        酶标仪测定OD值    
        计算蛋白上样量(建议每样本上样总蛋白含量为50 μg)

3. 样本变性  
        每40 μL蛋白,加10 ul的5XSDS 上样缓冲液
        沸水浴10 min  
        -20℃保存  

4. SDS-PAGE胶制备  
        灌入分离胶  
        无水乙醇压平  
        分离胶完全聚合后,倒出无水乙醇    
        双蒸水冲洗  
        滤纸吸干  
        加入浓缩胶    
        插上梳齿  
        浓缩胶完全聚合后取出梳齿  
 
5. 电泳  
        胶固定到电泳槽    
        倒入电泳液    
        加样,加marker,    
        电泳----80 V恒压至溴酚蓝到浓缩胶与分离胶交界处,改110 V恒压至溴酚蓝到凝胶底部

6. 电转移(湿转)
        取出凝胶  
        切胶  
        蒸馏水冲洗  
        滤纸准备  
        PVDF膜准备,甲醇浸泡5 s
        PVDF膜与滤纸一同浸泡于电转液中

        按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好

        电转 

        转膜时间  


7. 封闭    
        取出转好的PVDF膜,滤纸吸干电转液  
        放入封闭器内,加5%的脱脂奶粉或5%的BSA    
        室温封闭2 h  

8. 孵育一抗  
         取出封闭好的PVDF膜,滤纸吸干封闭液,  
         加稀释好的一抗,4℃孵育过夜  

9. 洗脱    
         TBST冲洗两分钟,摇床漂洗3次,每次5 min
 
10. 孵育二抗  
        取出洗脱好的PVDF膜,滤纸吸干洗脱液  
        加稀释好的二抗, 室温摇床孵育2 h
     
11. 洗脱
         TBST冲洗两分钟,摇床漂洗3次,每次5 min  
 
12. 曝光
        ECL底物1:1配比,现配现用  
        滤纸吸干PVDF膜  
        加入ECL底物  
        曝光  

13. 数据分析  
         Bandscan软件分析条带