ELISA标曲异常的原因及对策（上）

Source: Elabscience^®Published: 2022-10-26

ELISA实验中，标曲不仅能够帮助我们计算出样本浓度，还是指示实验人员操作手法是否规范的重要标志。

问：如何判断我绘制的标准曲线是否有效呢？

答：在显色阶段，控制标准品前4孔有明显的蓝色梯度，以及标准品最大OD值≥1.2，标准曲线的线性回归相关系数R²≥0.99，即可作为有效标曲。

但是，在ELISA实验过程中，往往有标曲异常的情况出现，下面将介绍几种特殊情况，并将其原因与对策一一道来。

例1：整体偏低

虽然标曲有一定梯度，但是最大OD值<1.2，梯度没有拉开。

可能原因：

1) 试剂盒过期或保存不当；

2) 标准品未溶解完全；

3) 加入终止液后，没有立即检测；

4) 试剂盒部分试剂（特别是洗涤液）混用其他批次，或为混用外源溶剂。

建议：

1) 按照说明书保存各组分，在保质期内使用；

2) 标准品溶解前，需要离心处理(10000×g离心1分钟)，加入1.0mL标准品&样品稀释液后，静置1-2分钟，用低速涡旋仪充分混匀；

3) 加入终止液后，请立即进行检测。若需等待，放置在避光处的时间不宜超过10分钟；

4) 使用试剂盒内一套完整的试剂，不要混用其他批次或外源溶剂。

例2. 无信号

标曲没有显色，OD值无梯度变化。

可能原因：

1) 试剂盒过期，或保存不当；

2) HRP酶受到污染，导致活力和效价降低；

3) 实验操作失误。例如：将生物素化抗体工作液和酶结合工作液的加样顺序颠倒；

4) 订购多个指标，实验时混用标准品、酶标板、生物素化抗体等。

建议：

为了快速排查原因，请尝试混合10μL底物溶液和2μL浓缩HRP酶，观察是否发生颜色变化，并及时对显色结果拍照。

如果有颜色变化（混用后呈现深蓝色/蓝绿色），表明HRP酶和TMB并无污染问题，可重新取一条板条，在避免以上问题的情况下制作标曲。

例3：整体偏高

酶标仪仪器光密度范围过广，导致检测OD值范围也很高。建议光密度范围设置在0-3.5之间。

可能原因：

部分OD值超出仪器检测范围，可能是由于工作液浓度过高，或孵育时间过长/温度过高。

建议：

1) 按照说明书要求，在工作液使用前15分钟，将浓缩液于800×g离心1分钟，以浓缩液：稀释液=1：99的比例，现配现用；

2) 孵育箱或烘箱需控制温度恒定37℃，温差不超过1℃，底物反应时间为15分钟左右。建议根据标准孔前4孔出现明显蓝色梯度，来控制实际显色时间，显色时间酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。

例4：全阳性