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Annexin V常见问题分析及解决方案

Source: Elabscience®Published: 2022-11-29

不久前,发布了文章:Annexin V凋亡实验注意事项(点击查看), 给大家讲解了Annexin V实验中的注意事项,好多同学跟反馈说,这些细节问题我在实验的时候都注意了,但实验结果还是很不理想。

出现异常实验结果时,我们该怎么办呢?

我们需要认真对待失败的实验数据,分析总结实验失败的可能原因,这样才能有针对性地重新实验,得到理想的实验结果。

本篇文章将结合多年实验经验,为大家带来Annexin V的常见问题分析,通过实际案例,让大家更深入地了解Annexin V实验

问题一:处理组晚期凋亡细胞分两群,缺少早期凋亡
Annexin V的常见问题

可能原因细胞处理条件太过剧烈,如:药物浓度过大、溶解药物的有机溶剂用量过大、极端条件(沸水等)处理细胞,导致细胞迅速死亡,呈现类似周期实验中细胞被固定的效果,缺少凋亡过程。

解决方案温和处理细胞,如:降低药物浓度;有机溶剂(DMSO等)的量最好控制在5‰以下。

问题二: 缺少早期凋亡细胞并且伴随大量坏死或裸核细胞

Annexin V的常见问题

可能原因药物处理时间过长,不耐药细胞凋亡后转向裸核,耐药细胞不再发生凋亡。

解决方案: 缩短药物处理时间(为保证凋亡效果,可以适当增加药物处理的剂量)。

问题三 : 核染(PI/7-AAD/DAPI),无阳性信号

Annexin V的常见问题

可能原因

解决方案

①核染料忘记添加

①重新实验,注意添加核染料

②试剂保存不当而失效,如7-AAD没在-20℃下保存

②重新购买试剂,注意试剂的保存条件

③细胞确实没有凋亡

③重新调整细胞处理条件,可以借助显微镜观察细胞是否凋亡

④阈值设置过大,凋亡信号没有收集到

④调整仪器设置,降低阈值

⑤贴壁细胞培养液上清中的细胞没有收集

⑤重新实验,注意收集上清中的细胞

问题四: 分群不明显

Annexin V的常见问题分析

可能原因

解决方案

①细胞带自发荧光

①更换其他标记的试剂盒

②细胞凋亡过多导致染料不足

②增加染料用量

③细胞状态较差,所有细胞都有一定的PS外翻

③培养、实验过程都需要温柔对待细胞

问题五:空白组有荧光信号

Annexin V的常见问题分析

可能原因

解决方案

①流式细胞仪没有清洗干净

①彻底清洗仪器

②荧光物质(如:阿霉素、四环素、细胞转染了带荧光的质粒等)干扰

②更换其他荧光标记的试剂盒,或者用其他物质培养细胞

③凋亡或者坏死的本底荧光

③空白组应选用状态良好的正常细胞,如细胞状态过差无法恢复或存在污染,应及时更换细胞

④细胞不纯

问题六: 正常细胞出现大量凋亡

Annexin V的常见问题分析

可能原因

解决方案

①细胞状态不佳

①调整细胞状态,重新培养细胞

②实验操作时手法粗暴,或细胞消化过度

②温柔对待细胞

③孵育时间过长,长时间处于非正常生长环境会导致细胞凋亡

③控制好实验的时间,如果样本太多,可以分批进行实验

④Binding Buffer稀释的问题:buffer未正确稀释,溶液渗透压异常导致细胞凋亡

④按照说明书要求进行操作


列举了一些Annexin V的常见问题分析及解决方案,希望对大家的实验有帮助~

Elabscience® Annexin V凋亡检测试剂盒 产品列表,欢迎查看并订购~


Annexin V凋亡实验注意事项

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