流式课堂 | 如何通过光谱图选择合适的检测通道？

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面对种类繁多的荧光染料，如何知道这些荧光素是否适合您所拥有的流式细胞仪，以及每种荧光素具体该选择哪个检测通道进行检测呢？这需要我们对所用的荧光素和用于检测的流式细胞仪有清晰的认识。我们需要关注荧光素的激发波长和发射波长以及流式细胞仪的激光器和滤光片参数，其中激发波长和激光器决定了目的荧光素能否在特定配置的流式细胞仪上被激发，发射波长和滤光片参数决定荧光素的荧光能否在该流式细胞仪上被检测到。一般来说，最大激发波长在激光器波长附近的荧光素一般都可以被激发；荧光素的最大发射波长落在滤光片的检测范围内时，其荧光可以被仪器检测到。

一．如何了解荧光素的激发波长与发射波长

通过光谱图我们可以很好的了解荧光素的波长信息，下面以FITC为例来为大家进行具体讲解：

FITC激发和发射光谱图

激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线。其峰值称为激发波峰（最大激发波长，Ex-Max）。

发射光谱（Emission，Em）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。其峰值称为发射波峰（最大发射波长，Em-Max）。

一般来说，荧光发射光能量比激发光能量低，发射光波长比激发光波长长。荧光染料在激发波段中的最大激发波长处，能激发出最强的荧光，得到荧光素的激发波长，就可以选择相应的激发光源进行激发。知道荧光素的发射波长，就可以选择最大发射波长处相应的滤光片进行检测。

二．激光器与滤光片

以Beckman的CytoFLEX为例，其仪器配置通常描述如下：

表格中，激发光波长“488 nm”表示该仪器配置有488 nm的激光器，荧光通道“525/40 BP”表示的意思为， 488 nm激光器下面配置有一个以525 nm为中心，宽度为40 nm的带通滤光片(BP, Band Pass)，即检测波长范围为525±20 nm的带通滤光片。

三．匹配荧光素与仪器

我们将仪器配置信息带入光谱图，即可得到下图：

在图中，蓝色虚线为FITC激发光谱，其最大激发波长为490 nm，红色实线为FITC发射光谱，其最大发射波长为530 nm。因此，FITC选择488 nm的激光器进行激发，选择525/40的滤光片进行检测。

以上为单激光检测，如果客户实验用到多色，需要考虑其它荧光对该通道的干扰。

不同流式细胞仪配置不同，我们以Beckman的CytoFLEX三激光流式细胞仪为例，Elabscience^®不同荧光染料最适激发光波长和荧光通道如下图所示：

注：不同仪器的滤光片会有少许差异，实际以仪器配置为准。

以Elab Fluor^® Violet 450为例：其荧光最适激发波长为405 nm（最适激发波长取决于流式细胞仪激光器的激发光），最适检测通道为450/45 (即检测波长范围为450±22.5 nm)的带通滤片。需要注意的是，荧光染料的发射波长相同或者相近，在流式细胞仪上是同一个检测通道，多色实验时，这类荧光染料不能同时使用。

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