ELISA实验样本处理方法

常规用于ELISA实验的样本包含血清、血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异，合适的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里，我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。

1. 血清

血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。

使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置1小时或4℃过夜，分离出血清（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清可以更大程度地分离出来）。2-8℃下以1000×g离心20分钟，小心收集上清液（血清），立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。

在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。

2. 血浆

使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，2-8℃下以1000×g离心15分钟，小心收集上清液（血浆）。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括EDTA钠盐，肝素钠，枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

3. 细胞培养上清

将细胞培养上清液吸入离心管中，在2-8℃下以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融。

4.   细胞提取液

反复冻融方法

1） 吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。

2） 将细胞悬浮液收集到离心管中，在2-8℃下以1000×g离心5分钟，然后吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次。

3） 加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。在6孔培养板（约1×10⁶个细胞）中，每个孔加入150-250μL的PBS来重悬细胞。

4） 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

5） 2-8℃下以1500×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

5. 组织匀浆

1） 用预冷的PBS（0.01M，PH7.4）冲洗组织以除去表面残留的血液或杂质（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果）。

2） 将组织块称重，然后切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆。

3） 加入适量的预冷PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。

4） 将匀浆液吸入离心管中，2-8℃下以5000×g离心5分钟，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反复冻融。

6. 唾液

在2-8℃下，4000×g离心10分钟以去除杂质，取上清即可检测。建议使用新鲜的唾液样本检测。

7. 尿液

使用无菌容器收集尿液样本。在2-8℃下，1000×g离心15分钟以去除杂质，取上清即可检测。

8.   粪便

将粪便样本用PBS(0.01M, pH=7.4)重悬,置于冰上振荡15分钟,然后在2-8℃，5000×g离心5分钟，取上清即可检测。

9. 其他生物体液

请咨询技术支持。

样品注意事项

1.   样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。融化样本在试验前请再次离心以去除冻融后可能出现的沉淀物。

2.   试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议查阅文献后先做预实验，以确定稀释倍数)。

3.   若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

4.   若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3，否则会造成假阴性结果。