免疫共沉淀实验指南

原理

       免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗原和抗体的特异性结合以及Protein A或G特异性地结合到抗体的Fc片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体，孵育后再加入Protein A或G预处理的Sepharose珠，若细胞中有与蛋白M结合的蛋白N，就可以形成这样一种复合物：“蛋白N-蛋白M—抗蛋白M抗体—Protein A或G—Sepharose珠”，经SDS-PAGE电泳分析检测结果。这种方法得到的目的蛋白N是在细胞内与蛋白M天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

步骤

1.   用预冷的PBS溶液洗涤贴壁细胞两次（对于悬浮细胞则用台式离心机以800-1000 rpm转速通过离心洗涤）。

2.   加入预冷的RIPA液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），RIPA液的用量：按照0.5 mL每5×10⁶ 细胞计算。

注：悬浮细胞，收集细胞沉淀后，加入预冷的RIPA液（含PMSF），RIPA液的用量：按照0.5 mL每5×10⁶ 细胞计算。轻轻混匀细胞悬液，用振荡器在4℃振荡15min以裂解细胞。 

3.   用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中。

4.   于4℃，10000 rpm离心裂解液15 min，迅速转移上清至另一离心管中，弃掉沉淀。

5.   将Agarose protein A+G珠子混匀：用预冷的PBS洗涤Agarose protein A+G珠子两次，并将其用PBS调制成50％悬液。

6.   每1mL细胞裂解液上清加入100 L Agarose protein A+G珠子，4℃振荡10 min，进行预清除。

7.   4℃，10000 rpm离心10 min移去Agarose protein A+G珠子，转移上清至一新离心管中。

8.   用Bradford法（考马斯亮蓝染色法）测定上清蛋白浓度。（应至少将细胞裂解液作1:10稀释后再测定，这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马斯亮蓝的作用）。

9.   根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度，用PBS将其稀释至1 mg/mL以降低缓冲体系中去污剂的浓度（但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言，10 mg/mL这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些）。

10.  加入推荐体积的免疫沉淀抗体至500 L细胞裂解液中与目标蛋白反应。（抗体的最适用量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定）。

11.  将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h，或4℃ 缓慢振荡过夜。（选择孵育2h常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。）加入100 L Agarose protein A+G轻轻振荡1h或 4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。

12.  离心（3000 rpm，5 min）收集Agarose珠子，弃掉上清，用800 L-1000L预冷的PBS缓冲液洗涤珠子3次。（小心吸取上清，避免触碰底部珠子）

13.  收集沉淀，加60 L 2×SDS蛋白上样缓冲液中重悬沉淀，轻混均匀后煮沸5 min，12000 rpm离心10 min。

14.  将上清转移至一新离心管，进行Western检测。