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Western Blot内参抗体选择原则

Western Blot内参抗体选择原则

2017-09-06作者:admin赞:2

Western Blot内参抗体种类很多,比如β-actinβ-tubulinGAPDHLamin B等,那么针对自己的实验,我们该如何做选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则:


> 样本的种属来源

选择内参抗体首先要考虑的是实验样本的来源。

1. 哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择β-actinβ-tubulinGAPDHLamin BHistone H3Na/K ATPase等。

2. 植物来源实的验样本,则可以选择plant actinRubisco等。

3. 其他来源样本研究较少,所以研究者就需要参照文献报导,选择合适的抗体作为内参


> 目的蛋白的分子量大小

选择内参抗体时应该考虑目的蛋白分子量的大小,通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上。比如目的蛋白分子量为45 kDa,此时不适宜选择β-actin(分子量为42 kDa)作为内参,可以考虑选择GAPDH(分子量为38 kDa)或者β-tubulin(分子量为55 kDa)作为内参。


> 目的蛋白的表达部位

一般实验主要是检测胞浆内的表达蛋白,选择β-actinβ-TubulinGAPDH的抗体就可以了;而对于核蛋白的定量,特别是样本来源于细胞核内蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值,常用的核内参抗体有Lamin ALamin BHistone H3,除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNAK70K80等,在一些文献报道中,Erk2TATA binding protein(TBP)以及c-Junc-Fos等都有使用;对于膜蛋白检测,最常用的内参抗体为Na/K ATPase;对于线粒体蛋白的检测,常用VDAC1COX IV作为内参抗体。


以上几条原则只是针对通常情况,需要注意的问题是——内参的选择还需要考虑实际的实验环境,比如某些细胞由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高,此时GAPDH就不适合做内参了;再比如在涉及细胞增殖相关试验中,c-Jun由于自身表达变化也不适合做内参;而在凋亡实验时,TBPLamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案时应该综合考虑多方面因素并查询相关文献,在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常,可能是由于特殊原因导致,因而需要查阅相关文献并更换其他抗体作为内参。

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