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流式抗体选购常识

流式抗体选购常识

2017-09-06作者:admin赞:1

流式细胞实验过程中,荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此选购流式抗体时需要综合考虑各种影响抗体品质及检测效果的因素,例如抗体的特异性、荧光素信号的强弱、荧光素标记的方式、同型对照等等。


如何选择合适的流式抗体?

1. 流式抗体本身也是抗体,所以选择流式抗体首先要满足抗体选择最基本的条件:目标蛋白识别特异性、反应种属以及应用实验;
2. 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中,遵循尽量减少实验工序和过程以保证实验的真实性和准确性,因此在条件允许的范围内,建议尽量用直接标记的抗体进行实验;
3. 流式抗体荧光标记的选择:不同荧光标记在不同的仪器上强度不同,以FACS Calibur仪器为例:PE APC PE-Cy5 PerCP-Cy5.5 FITC PerCP,通常来说,PE最强,适用于弱表达抗原;FITC强度较弱,适用于强表达抗原并且使用范围比较广泛。如果实验中检测单一指标,用户可根据检测的目标蛋白表达丰度进行选择同时可兼顾标记抗体的价格等综合因素;如果同时检测多个指标,用户先需要确认流式细胞仪能检测多少个通道-------流式抗体每个通道只能选择1种荧光素,各个通道之间的荧光素可以随意搭配,比如实验者同时检测三个指标,可以在下图中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记,例如FITCPEPE-Cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记,以防止荧光的重叠和相互干扰,影响最后的实验结果。因此,流式细胞仪的通道越多,同一份样本可同时做的表面/胞内标志就越多。常用的荧光标记包括FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy5.5, APC等。


同型对照的选择

流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色,相当于实验的阴性对照。同型对照选择与标记抗体同种属来源、同亚型、同荧光标记的抗体。例如抗人的CD3PE标记的抗体,如果抗体来源于小鼠、亚型为IgG2a的话,就必须选择PE标记的小鼠的IgG2a作为同型对照。

流式抗体使用注意事项

1. 建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能影响到实验结果,因此建议实验前先优化一下试验条件。注:不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异,例如传统流式细胞术 (采用鞘液流系统)需要1×106个细胞为起始上样量,抗体用量为10 μL,而微流式细胞术则只需5×105个细胞,抗体用量相应的可减少到5 μL
2. 带荧光素标记的流式抗体应该4避光保存,不要冷冻。

3. 尽量选择经实验验证的流式抗体,以保证实验结果。Elabscience®流式抗体已通过实验验证,并且提供了相关数据图供用户参考。


相关参考

流式细胞术(Flow CytometryFCM):是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球、细菌、小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞术产生于上世纪六七十年代,具有速度快、精度高、准确性好等优点,是非常先进的细胞定量分析技术。该技术被广泛的应用于细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等多个领域,如细胞周期、细胞凋亡、细胞活力的检测、淋巴细胞亚群与疾病的关系研究、器官移植后的免疫学监测、肿瘤的特异性指标的检测、药物作用机制研究、筛选新药等等。