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免疫组化抗体选择要点

2017-09-06作者:admin赞:0

一抗的选择要点

1.     选择单克隆还是多克隆抗体?由一种B细胞产生的单一特异性抗体叫做单克隆抗体,单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合,就像导弹精确地命中目标一样。另一方面,即使是同一个抗原决定簇,在机体内也可以由好几种B细胞产生抗体,形成抗体混杂物,称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中,一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小、检测抗原灵敏度相对较低;而多克隆抗体特异性稍弱、抗体的亲和力强、灵敏度高,但易出现非特异性染色(实验时可以通过封闭等尽量避免非特异性染色)。

2.     抗体的种属来源。一般兔来源的抗体多是多克隆;而小鼠来源的抗体多是单克隆,但也有例外。抗体的来源这点非常重要,后面检测时带标记的二抗必须与一抗来源相匹配。

3.     实验目的是检测什么种属的抗原,即Species Reactivity。这一点很重要,一般说明书上都有注明,如小鼠Mouse、大鼠Rat、人Human等等,选购时尽量选择说明书上已经标注反应性的抗体。

4.     能否做免疫组化?一般一抗说明书都会注明是否能做WBIHCICCIF等,建议最好选择注明的抗体,因为一般都是经过实验验证的。

5.     检测标本类型。用户是检测石蜡切片还是冰冻切片,一般能做石蜡切片的抗体,都可以用来检测冰冻切片;但能做冰冻切片的抗体,不一定能检测石蜡切片中的抗原。

6.     价格与质量。进口抗体时间长,且价格高,很多都是国内厂家OEM的,科研型的抗体属于浓缩型抗体,需要多摸索几次实验条件,建立合适的实验条件后再进行大批量的实验,并且实验操作者的熟练程度、对实验的把控等对实验结果影响也很大,实验细节一定要把控好。另外,抗体切记避免反复冻融。


二抗的选择

1.     种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源,如一抗是小鼠来源,那二抗就买抗小鼠的即可(二抗来源goat or Rabbit均可);如一抗是兔来源,那二抗就买抗兔的即可。

2.     标记物的选择。常见的标记物有HRPBiotin、荧光素等。免疫组化现阶段多用二步法,二步法使用的二抗通常是带多聚HRP标记的,普通的HRP标记应用到免疫组化效果会比较差;前几年应用比较多的三步法,二抗上带Biotin标记,然后加入HRP标记的链霉素进一步反应。而免疫荧光染色就需要购买荧光素标记的二抗,如罗丹明、FITCCy3等常用荧光素。如何选择二抗主要看实验应用是免疫组化还是免疫荧光。

3.     选择IgM还是IgG。二抗需与一抗的类别或亚型相匹配,这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体

        单克隆抗体的类别及亚型通常会在产品列表中列出,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM,或是抗小鼠IgG抗体。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚型(IgG1IgG2aIgG2bIgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚型的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。如果你不知道一抗是哪一类别或亚型,那么抗小鼠IgG是一个不错的选择,因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

4.     生产厂家Elabscience®公司提供免疫组化染色试剂盒,内含 3% H2O2去离子水、 Polymer Helper (即用型)、polyperoxidase-anti-Mouse/Rabbit IgG(即用型),故试验中只需摸索一抗的浓度即可,3 mL包装的免疫组化试剂盒常规大约可以做60张切片。