多色流式实验荧光染料的选择
Source: Elabscience®Published: 2017-12-19
如今，流式细胞术已经成为一项功能强大的技术，可在数秒内对数千个单个细胞或其他颗粒的多项参数进行分析。在流式细胞分析中，荧光染料受到一定波长的激光激发后，释放出的能量能发射出一定波长的荧光，因此我们在选择荧光染料时应注意它们的激发波长和发射波长，以选择正确的激光器和荧光染料组合。随着多色流式细胞仪的出现，新荧光染料和标记抗体也得到了长足发展。然而荧光染料的发射光谱并不是与流式细胞仪的检测通道完美对应的。在大多数情况下，一种染料的发射光谱常常会横跨多个检测通道，这样会造成其它通道的信号造成干扰。并且不同蛋白的表达水平、染料的亮度都各不相同，如果染料搭配不合理，可能会对数据分析造成巨大困扰，甚至会因数据完全无法分析而导致实验失败。针对每个多色流式检测实验，设计合理的颜色搭配，会大大提高实验效率。虽然为实验中所需抗体选择最佳的荧光染料组合是一个复杂的过程。但其中并非无规律可寻。Elabscience®的技术团队总结了一些常用流式荧光染料和多色流式细胞中荧光染料的选择原则，帮助您避免重复实验和错误，增加实验的成功率。
1. 常用荧光染料的种类特性及检测滤片
面对种类繁多的荧光染料，如何知道这些染料是否适合您所拥有的流式细胞仪，以及这些染料间该如何补偿呢？这需要我们对所用的染料和用于检测的流式细胞仪有清晰的认识。对于多色标记，我们通常需要关注染料的激发波长和发射波长以及探测器前的虑光片参数。其中激发波长决定了目的染料能否在特定配制的流式细胞仪上被激发，发射波长和滤光片参数决定染料的荧光能否在该流式细胞仪上被检测到。一般来说，激发波长在激光器波长附近的染料一般都可以被激发；染料的发射波长落在滤光片的检测范围内时，其荧光可以被仪器检测到。关于下表中带通滤光片参数，斜线前的数字表示中心波长，斜线后的数字表示通透的宽度，如525/50，表示中心波长为525nm，通透的宽度为50nm，即500 ~ 550nm的荧光相对于这个滤光片是通透的。
注释：
a. 以eFluorTM450为例:其荧光激发峰有405nm和407nm,最大发射波长为450nm（最大激发波长取决于流式细胞仪激光器的激发光），需440/40 (即检测波长范围为440±20nm)或450/50 (即检测波长范围为440±25nm)的带通滤片(BP, Band Pass)。
b. 以eFluorTM605NC为例:其荧光激发峰有335nm, 405nm和407nm,最大发射波长为605nm ，流式细胞仪检测时需605/40 (即检测波长范围为605± 20nm)的带通滤片。
注释：
a. 表中数值表示各荧光检测通道间的荧光补偿值(compensation)，单位为%。
b. 以FITC和PE为例：假如我们用FLi-%FLj，表示从第i通道扣除从第j通道漏过来的荧光时，设置的荧光补偿值；那么流式细胞仪的FL1通道检测FITC，FL2通道检测PE，则需将仪器的补偿设置为FL1-%FL2=1.10，FL2-%FL1=16.52。可以简单理解为：PE荧光染料的1.10%漏到FL1检测通道,需从FL1中减除，而FITC荧光染料的16.52%漏到FL2检测通道，需从FL2中减除。
2. 常见荧光染料亮度比较
荧光染料的亮度可以用来比较不同荧光染料的荧光标记效果，通过阴性细胞群与阳性细胞群的荧光信号之间的关系来表示。但是阴性细胞群的荧光信号受到信号强度、自发荧光、非特异性染色、仪器的电子噪声等多个因素相关。为了避免这些不易控制的因素干扰对荧光染料亮度的判断，科学家们提出了染色指数（Stain Index）的概念。
染色指数定义为阳性细胞群的平均荧光强度与阴性细胞群的平均荧光强度之差与阴性细胞群荧光强度标准差之间比值的一半。染色指数只和抗体克隆号与质量、荧光基团纯度与质量、荧光修饰比、激光线及其功率、长通和带通滤光片、目的细胞等因素相关。总体来说，染色指数与荧光染料的亮度呈正相关，即荧光染料亮度越高，其染色指数越高，反之亦然。
因此，通过染色指数可以看出常见的荧光染料的亮度：PE > APC > FITC > PerCP。
3. 多色流式细胞检测中荧光染料的选择原则
1) 根据机器配置选择最亮的荧光染料
了解你使用的流式细胞仪的性能，大多数流式细胞仪有两个或者多个激光器，有五种波长可供选择：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）。除了激光器，具体的虑光片和检测器也决定了你的配置可同时检测多少种颜色。
多色标记荧光染料尽量选用不同激光激发的染料。荧光染料在同一激光激发的染料中选择时，优先选择亮度高的染料，以保证最佳分辨率。常用的高亮度染料有PE、PE/Cyanine5、PE/Cyanine7、APC、AF647等，但是并不是说染料亮度高，在您的流式细胞仪上就能获得较好的信号，这还需要您的仪器的配备合适的激光、滤光片和探测器。
2) 平衡抗原表达水平和染料荧光亮度
在单色流式检测实验中，我们通常会选择亮度最强的几种染料，如PE、APC等等。但是，在多色流式检测时，有时因为颜色的限制不得不用到一些亮度较暗的染料。为了保证每个通道的分辨率可接受，我们需要合理搭配抗原和染料。一般来说，较暗的染料，如FITC、PerCP等，优先分配给表达量高的抗原，而PE、APC、PE/Cy5等较亮的染料可以分配给表达量低或者分辨率要求比较高的抗原。合理配色的最终结果是让不同表达水平的抗原检测到的信号尽量均衡。
3) 保证搭配荧光染料的质检发射光谱重叠度尽量小
如前所述，当两种荧光染料的发射光谱重叠时，它们的荧光信号将会互相干扰，给数据分析带来麻烦。虽然荧光补偿技术可以将干扰扣除，但补偿值越大，补偿后的信号分辨率会降低越厉害。最好选择很少或者没有重叠的荧光基团，以最大限度减少这种渗漏。不同激光激发的染料是首选，如PE和APC，但在某些情况下，这可能与尽量选择亮的荧光素的规则是冲突的。如在进行四色分析时，不会将PE-Cyanine5标记的抗体与APC标记的抗体搭配使用。因为Cyanine5的激发波长与APC的激发波长相近，所以PE-Cyanine5与APC均可被红色激光（640nm）所激发，而两者的发送光谱也比较接近，导致PE-Cyanine5与APC的颜色补偿很难调整。相反，由于PE-Cyanine5.5中的Cyanine5.5激发波长为675nm，不能被红色激光器所激发，也就不存在Cyanine5.5对APC的干扰，所以用PE-Cyanine5.5对APC基本没有串色。因此，可能需要牺牲个别荧光染料的亮度来避免荧光渗漏以及分辨率下降。
要通过单标对照进行补偿调节：
所以尽量选择光谱重叠度小的荧光染料，如FITC/PE-Cyanine7；
选择不同激光激发的荧光染料，如FITC/APC, PE/APC。
4) 尽量避免偶联荧光染料使用带来的假阳性
随着颜色的数量不断增加，实验中可能会用到串联荧光染料。串联荧光染料是指通过共价键方式将两种染料串联，其中一种染料的发射光谱与另外一种染料的激发光谱部分重叠，如PE-Cyanine7或APC-Cyanine7。串联荧光染料很容易降解，重新分解为原来的两个染料，从而出现对应两个通道的假阳性，若使用串联的荧光染料，务必要在短时间内尽快完成实验，曝光时间越长，荧光染料就越不稳定。在固定和透化的过程中，偶联荧光染料的亮度可能降低，因此操作步骤应当尽可能温和。
