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流式细胞术实验流程

流式细胞术实验流程

2017-12-22作者:admin赞:12

流式细胞技术(Flow cytometry, FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物,它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体,检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。


一、细胞表面染色步骤

1. 样本准备

1) 采集全血或组织(脾,淋巴结,胸腺和骨髓),用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。对于体外刺激的细胞,直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中,然后进行第2步。

2) 加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。


2. 红细胞裂解

1)  如需裂解红细胞(如脾脏),将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x,放置到室温。将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中,室温孵育3-5分钟;如不需要裂解红细胞,直接进入第3步,。

2)  加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解,300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。

3)  重复洗涤一次,加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。

4)  细胞计数,用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。将100μL细胞悬液加入流式管中备用。


3. 封闭Fc受体

封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

小鼠中,纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合,封闭非特异性染色,使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体,室温孵育10分钟。

对于人和大鼠,可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断,或者用商业化的Fc受体阻断剂。


4. 细胞染色

1) 按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体,混匀后置于4℃,避光孵育30分钟。

2) 加入5 mL细胞染色buffer (或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞,300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。

3) 加入0.5 mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞,用流式细胞仪进行检测和分析。


注意事项

1. 在抗体使用之前,快速离心一下,使之聚集到管的底部。

2. 荧光标记的抗体应该避光4℃保存,不要冷冻。

3. 当染色的时候,固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果,染色后应该马上分析。

二、细胞内细胞因子染色步骤

1. 细胞准备:

1)收集细胞。经刺激和阻断处理的细胞(具体处理方案请参考文献进行),加细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液,调整细胞浓度约为1 × 107/mL。

2)取100 μL细胞/管(约1 × 106细胞),分别加到做好标记的流式管底部。


2. 固定:

1)如需要表面染色,则先依照“细胞表面染色步骤”选用适宜抗体进行表面染色。

2)用1×细胞固定/破膜液(Fixation/Permeabilization buffer),将流式管中的细胞重悬,室温避光孵育30分钟。

3)300g离心5分钟,弃去上清。


3. 破膜:

3.1 用1×细胞破膜buffer(Permeabilization Buffer)将固定过的细胞悬起,300g离心5分钟,弃去上清。

3.2 重复洗一次,300g离心5分钟,弃去上清。

3.3 加入1 mL的1×细胞破膜buffer(Permeabilization Buffer),4℃避光孵育30分钟;300g离心5分钟,弃去上清。


4. 胞内染色:

4.1 用100 μL的 1×细胞破膜buffer(Permeabilization Buffer)重悬细胞,加入相应的抗体,混匀,4℃避光孵育至少30分钟。

4.2 加入2 mL的 1×细胞破膜buffer(Permeabilization Buffer)重悬细胞,300g离心5分钟,弃去上清。

4.3 加入2 mL的细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞,300g离心5分钟,弃去上清。

4.4 加入0.5 mL的细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞,用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项

1. 同一个细胞同时做细胞表面和细胞内的蛋白,建议先做细胞表面染色,再固定、破膜。

2. 细胞内染色推荐使用同型对照。
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