流式实验常见问题及解决方案

可能的原因

解决方法

抗体贮存和操作不当

抗体应保存在2-8℃中，避光保存，同时避免反复冻融

荧光染料淬灭

荧光抗体和荧光抗体染色后的样本都应该避光保存

自发荧光较高

改变抗体的荧光染料形式，避开与自发荧光相同发射光或者补偿较大的染料

染色时间和温度不正确

适当调整染色时间和温度

使用错误的染色液染色细胞内蛋白

为了获得最佳细胞内蛋白染色，应该使用正确的固定破膜剂进行细胞固定并破膜，以检测胞浆和细胞核蛋白

分泌性胞内蛋白

流式细胞检测时，细胞因子、趋化因子和生长因子等分泌性蛋白必须使用阻断剂使其保留在细胞内

蛋白质下调，内化或从细胞中被剪切

确定使用的刺激条件不会影响蛋白质定位

蛋白的表达水平过低

对于表达水平过低的抗原，染色时使用最亮的荧光染料，两步法染色有时可以对信号进行放大，例如先使用生物素化抗体，再使用荧光标记二抗染色

细胞的分离方案或冷冻贮藏破坏抗原

从固态组织或细胞培养皿中收集细胞使用的酶会破坏细胞表面蛋白质，尝试用非酶的试剂制备细胞。检测制备细胞的试剂和细胞的贮藏/处理，是否可能影响抗原

仪器检测通道异常

使用流式细胞仪质控微球，以检查流式细胞仪各通道性能

使用的滤光片不正确

检查所用荧光染料的激发波长与发射波长，确保使用正确的激光器和滤光片收集数据

数据过度补偿

利用单阳对照和荧光减一（FMO）对照为每次实验设定补偿

细胞群的设门不正确

确保对细胞群的正确设门，使用死活染料并对单细胞群设门，可大幅度减少假阳性

数据分析不正确

为最佳显示稀有细胞或低表达水平的细胞，利用双参数图观察细胞

可能的原因

解决方法

自发荧光较高

使用相同刺激条件，但不用任何试剂染色的样本作为细胞自发荧光的对照

抗体与死细胞结合

染色中包含使用死活染料染色，来排除死细胞

Cyanine 5染料

Cyanine 5和其它Cyanine 5的串联染料，会与特定细胞的Fc受体非特异性结合，例如单核细胞和巨噬细胞，考虑使用其它荧光染料

抗体浓度过高

滴定抗体的用量

二抗/试剂非特异性结合

滴定二抗，使本底降至最低程度，阻断Fc受体，确保使用已经被高度认可无非特异性的二抗

染色时间太长

根据实验细胞表达，优化抗体浓度和孵育时间

洗涤不充分

增加染色后的洗涤次数

补偿调节不足

利用单阳对照和荧光减一（FMO）对照为每次实验设定补偿

可能的原因

解决方法

使用的同型对照浓度不对

使用与检测抗体浓度相同的同型对照

同型对照来自于不同厂家

使用与实验抗体同一厂家生产的同型对照

分析中包含细胞黏连体或死细胞

单细胞群设门，并使用死活染料，排除黏连体和死细胞

固定/破膜液影响细胞特性

调整阈值，确保细胞处理阈值范围内

刺激条件改变细胞特性

使用标志物反圈门识别细胞