检测前必备！总蛋白的提取和测定方法

在科学研究的实验中，总蛋白含量是最常见的测定指标之一。在对组织或细胞样本进行代谢物检测、免疫沉淀、ELISA实验、WB实验、激酶测定等实验的过程中，都需要提取样本中的总蛋白，并对其含量进行测定。

应用

总蛋白含量的测定有多种应用场景，常见可分为以下3类：

Part.1

蛋白质含量如血清总蛋白是肝功能检测中的常用指标之一，反映了肝脏的合成功能。当肝脏出现病变时，肝细胞合成蛋白质的能力出现异常，导致血清总蛋白含量发生变化。因此，血清总蛋白含量常用于肝硬化、肝炎、肝癌等疾病的辅助诊断和严重程度判定。

Part.2

对于组织或细胞样本，总蛋白含量测定结果还在多种实验中作为校正参数发挥重要作用。在代谢检测实验中，检测组织或细胞样本的代谢物含量或目标酶活性时，通常需要使用样本匀浆液的总蛋白含量进行结果校正。组织或细胞样本匀浆的目的是利用机械或超声等方式破碎细胞，将细胞内的待测物释放到溶液中进行检测，只有细胞破碎后释放出的物质才能被检测到。但在进行不同批次的实验时，无法保证每次细胞的破碎比例完全相同，如当破碎程度为60%时，只能检测到样本中待测物质60%的含量。因此，直接比较每个样本中的待测物含量有时并不能准确反映出它们之间的变化关系。但相同组织或细胞类型中，每个细胞破碎后可释放出的蛋白质总量基本一致，测定细胞破碎后释放出的蛋白质总量可以反映破碎的细胞数量，因此可通过测定样本匀浆上清液中的总蛋白含量，将其作为校正参数代入计算，以消除因细胞破碎程度不同而引起的误差。

Part.3

在其他蛋白免疫实验方法中，也会用到总蛋白含量作为校正参数。如在Western Blot (WB)实验中，通常使用泳道总蛋白来进行归一化校正，确保实验结果的可靠性，消除由于蛋白样本浓度不同、凝胶上样不一致等原因造成的偏差。通过直接测定样本中总蛋白的含量，将每个样本中目标蛋白的含量与总蛋白含量相除，得到每个样本中目标蛋白的相对含量，再进行样本间的相互比较。

测定方法

总蛋白的测定有多种方法，目前实验室中常用的有BCA法、考马斯亮蓝法（Bradford法）、双缩脲法三种，它们分别具有不同的优势和缺陷，在使用时可根据样本特点进行选择。

总蛋白的提取

在蛋白质的提取、表达和分离过程中，内源性蛋白酶会迅速开始降解蛋白质样品，从而降低用于蛋白质表征和分析的样品质量和含量。因此，在提取过程中，为了确保所提取的蛋白的完整性， 通常需要将几种不同的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按照特定的比例混合加入缓冲液中，以确保蛋白质在下游分析前不被降解，并能保持其修饰的活性状态。

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