组织单细胞悬液制备中各种酶的特性及应用场景
Source: Elabscience®Published: 2023-02-02
组织由细胞和细胞外基质（ECM）有序而紧密地联结在一起。从组织中获取单细胞悬液，应用于流式检测、单细胞测序、体外培养、药物筛选、细胞移植、类器官培养以及肿瘤研究等方面，更接近体内的天然状态，具有很多优势。
要想获得高品质的单细胞悬液，需要采取一些有效措施，其中，酶消化法就是一种既能维持细胞的最佳状态、又能有效地获得单个细胞的方法。
消化组织的酶多种多样，常见的消化酶主要有以下几种。根据消化原理的不同，其应用场景也各不相同：
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分类 |
原理 |
应用 |
注意事项 |
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胰蛋白酶 |
作用于赖氨酸或精氨酸结合的肽腱，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而分离细胞 |
用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织；不适用于纤维组织和较硬的癌组织 |
EDTA可以用来增强胰蛋白酶的水解功能，血清会影响胰蛋白酶的活性 |
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胶原酶 |
胶原酶Ⅰ |
水解细胞间质的脯氨酸，分离细胞，仅对细胞间质有消化作用，对细胞的损害小 |
消化上皮、肺、脂肪、肾上腺上皮细胞 |
钙镁离子和血清不会对胶原酶的活性及消化作用产生影响 |
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胶原酶Ⅱ |
消化肝脏、骨、软骨、肿瘤、甲状腺、心脏、唾液腺组织细胞 |
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胶原酶Ⅲ |
可消化所有哺乳动物组织 |
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胶原酶Ⅳ |
可消化多种组织 |
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胶原酶Ⅴ |
消化胰岛小岛组织 |
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透明质酸酶 |
通过随机降解透明质酸的β-N-乙酰己糖胺-[1-4]糖苷键，降低透明质酸的活性 |
常和胶原酶搭配，消化结缔组织 |
常规情况下较稳定，不会分解 |
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DNaseⅠ |
作用于细胞分离降解出的DNA，避免DNA引发的细胞凝集，对细胞完整性无破坏作用 |
常配合胶原酶或透明质酸酶等联合使用，一般不会单独使用 |
EDTA等金属离子螯合剂，达到mmol/L浓度的锌离子，0.1%的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100 mM以上盐浓度均对DNase Ⅰ有显著抑制作用 |
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中性蛋白酶 |
中性蛋白酶只水解由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等疏水大分子氨基酸提供氨基的肽键 |
具有温和的蛋白酶水解活性，不会损坏细胞膜的完整性，常与胶原酶等联合使用，其分离纤维样组织的效率高于上皮组织 |
大多数微生物的中性蛋白酶是金属酶，热稳定性较差，很易自溶，钙离子可以增加酶的稳定性，并减少酶自溶 |
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弹性蛋白酶 |
作用于弹性蛋白的肽键、酰胺键和酯键将其水解，可水解天然的弹力素 |
常与胰蛋白酶和胶原酶等联合使用，用于分离结缔组织和含有大量细胞网状纤维的组织。很适合消化肺脏，分离肺泡Ⅱ型细胞 |
作用的最适pH值7.8，最适作用温度25℃ |
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木瓜蛋白酶 |
属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有两个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键 |
常用来分离皮层神经元、视网膜、平滑肌 |
最适合的pH值6～7；最适合的温度55～65℃，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制、还原性物质激活 |
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由于不同组织的细胞和结构不同，利用单一的酶消化细胞无法达到良好的效果，常常需要几种不同的酶混合搭配，才能获得性能最佳的单细胞悬液。针对具体的组织，仍需试验摸索，以确定最佳消化方案。以下列表方法供大家参考。
表一：人体组织常用的消化方案参考
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类别 |
组织 |
消化酶 |
参考文献PMID |
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人-正常组织 |
心肌组织 |
胶原酶Ⅱ（200 IU/mL） |
28202059 |
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肝脏 |
胶原酶D（2.5 mg/mL） |
25533785 |
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DNaseⅠ（0.1 mg/mL） |
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肺实质 |
胶原酶（300 U/mL） |
3026698 |
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DNaseⅠ（50 U/mL） |
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肺 |
蛋白酶XIV（2 mg/mL） |
7681268 |
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凝乳酶（0.5 mg/mL） |
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肾脏 |
胶原酶Ⅰ（0.025%） |
31385550 |
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牙髓 |
胶原酶Ⅰ（2 mg/mL） |
24831838 |
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扁桃体 |
胶原酶（1 mg/mL） |
27598832 |
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DNaseⅠ（0.25 mg/mL） |
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胎盘组织 |
胶原酶Ⅱ（0.25%） |
30122114 |
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胰蛋白酶（0.25%） |
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胎盘 |
胰蛋白酶（0.25%） |
30541665 |
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DNaseⅠ（200 µg/mL） |
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人-肿瘤组织 |
鳞状细胞癌 |
胰蛋白酶（0.05%） |
2452013 |
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EDTA（2 mM） |
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神经纤维瘤 |
中性蛋白酶（1.25 U/mL） |
1696266 |
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胶原酶Ⅰ（0.05%） |
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透明质酸酶（0.1%） |
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胶质瘤 |
胶原酶Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅺ （1 mg/mL） |
27598832 |
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DNaseⅠ（0.25 mg /mL） |
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黑色素瘤 |
胶原酶Ⅳ（1 mg/mL） |
23525090 |
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DNaseⅠ（0.1 mg/mL） |
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肺肿瘤 |
胶原酶Ⅰ（170 mg/L） |
25359999 |
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胶原酶Ⅱ（56 mg/L） |
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胶原酶Ⅳ（170 mg/L） |
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DNaseⅠ（0.002%） |
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弹性蛋白酶（0.002%） |
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乳腺癌 |
胶原酶Ⅰ（4 mg/mL） |
30692706 |
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透明质酸酶（1 mg/mL） |
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胰蛋白酶（0.1%） |
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结肠癌 |
胰蛋白酶（0.25%） |
6830688 |
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EDTA（0.19%） |
表二：小鼠组织常用的消化方案参考
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类别 |
组织 |
消化酶 |
参考文献PMID |
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小鼠-正常组织 |
心脏 |
胶原酶Ⅳ（0.1%） |
17577582 |
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胰蛋白酶（0.2%） |
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肺 |
弹性蛋白酶（4 U/mL） |
29956144 |
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中性蛋白酶（1 U/mL） |
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DNaseⅠ（200 μg/mL） |
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胸腺 |
胶原酶D（0.125%） |
25367128 |
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DNaseⅠ（0.1%） |
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胃 |
中性蛋白酶Ⅱ（0.72 mg/mL） |
29322413 |
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胶原酶A（1 mg/mL） |
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小鼠-肿瘤组织 |
肺癌 |
中性蛋白酶（50 U/mL） |
22064658 |
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胶原酶（400 U/mL） |
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DNaseⅠ（50 U/mL） |
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乳腺肿瘤 |
胶原酶（1.5 mg/mL） |
23959163 |
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透明质酸酶（20 μg /mL） |
表三：大鼠组织常用的消化方案参考
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类别 |
组织 |
消化酶 |
参考文献PMID |
|
大鼠-正常组织 |
心脏 |
胶原酶Ⅱ（200 IU/mL） |
28202059 |
|
肝脏 |
胶原酶Ⅳ（0.5 mg/mL） |
27054325 |
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DNaseⅠ（20 μg/mL） |
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肾脏 |
胶原酶（1 mg/mL） |
28668953 |
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大鼠-肿瘤组织 |
结肠癌 |
胶原酶Ⅰ（1.6 mg/mL） |
23193035 |
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透明质酸酶（20 μg /mL） |
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DNaseⅠ（60 μg/mL） |
举个例子
4T1荷瘤小鼠的酶消化过程及染色流程如下所示：
（1）10×混合消化酶的配制：取80 mL HBSS缓冲液， 加入1 g胶原酶 IV，100 mg透明质酸酶，为降低细胞粘稠度和凝集，额外加入20,000 U DNaseⅠ，充分溶解混匀，补加HBSS缓冲液，定容至100 mL，使用0.22 μm的滤膜过滤，分装成5 mL/支，储存于-20℃条件下，使用前恢复至室温；
（2）肿瘤分离：用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，放置于含有75%酒精的烧杯中，浸泡3~5 min，使用剪刀和镊子剥离肿瘤，PBS洗涤2次；
（3）肿瘤组织的消化：将肿瘤转移至1.5 mL EP管中，手持弯剪，插入EP管反复剪切至大小约为0.5~1 mm3的颗粒，补加1 mL HBSS缓冲液，转移到15 mL离心管，再使用8 mL HBSS缓冲液重悬肿瘤颗粒，加入1 mL 10×混合消化酶，轻轻吹打混匀，在摇床上以80 rpm、37℃的条件消化1~2 h；
★注：10 mL消化液可充分消化体积约为1 cm3的肿瘤组织。
（4）单细胞悬液的制备：每30 min使用1 mL移液器吹吸组织块1次，至吹吸无明显阻碍视为消化彻底， 用100 μm筛网过滤除去杂质，并使用大体积约50 mL的HBSS缓冲液洗涤一次，300 g离心5 min，弃上清，补加适当体积的HBSS缓冲液或PBS缓冲液重悬细胞沉淀，即为肿瘤单细胞悬液；
（5）流式染色：细胞计数，调整细胞到合适的密度（1*107/mL），并进行流式染色和分析。
图1：混合酶消化后的4T1肿瘤细胞，使用PerCP/Cyanine5.5 Anti-Mouse CD45 Antibody[30-F11]（Cat.：E-AB-F1136J），FITC Anti- Mouse CD3 Antibody [17A2]（Cat.：E-AB-F1013C），PE Anti-Mouse CD4 Antibody [GK1.5]（Cat.：E-AB-F1097D），APC Anti-Mouse CD8a Antibody [53-6.7]（Cat.：E-AB-F1104E）进行标记染色并分析。
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