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流式实验对照设置之单阳对照

Source: Elabscience®Published: 2022-05-16

多色流式实验中,由于不同荧光素的发射波长的覆盖范围不同,可能产生重叠,对实验结果的数据分析造成一定干扰,我们通常会设置单阳管进行调节补偿。同时,单阳管还可以辅助我们调节通道电压,防止信号超出接收范围。

常见荧光素的发射光谱

图示:常见荧光素的发射光谱


A. 如何设置单阳管

单阳管即单染管,是只添加一种荧光抗体的样本管。一般来说,实验panel有几种荧光,就需要设置几个单阳管。如:APC、PE、FITC的三色panel,需要设置三个单阳管。

B. 制备单阳管的要求

①单阳管和全染管的样本类型、荧光素要保持一致;

②单阳管和全染管的样本处理要相同,如:全染管进行了固定破膜处理,单阳管即使是表面因子,也需要进行固定破膜;

③单阳管上机的电压要和全染管保持一致;

④单阳管要保证有足够的阳性细胞群。

C. 单阳对照常见问题

目标marker表达量高,阴阳细胞分群明显,也需要设置单阳管吗?

如果panel的指标少,可以不用设单阳管,通过手动调节补偿,将细胞调整到横平竖直的状态即可。但是,如果panel的指标比较多,就必须都设置单阳管。

补偿前 ↓

荧光补偿前


补偿后

荧光补偿后

图示:FITC和PE之间存在荧光补偿,但CD4和CD8细胞分群明显,且整个panel只有三色,可以进行手动调节补偿。


某些marker的表达量比较低,单阳管的阳性群细胞不明显怎么办?

在设置单阳管的时候,我们会发现,一些低表达marker(Foxp3、IL-17A、IFN-γ等)的阳性群非常少,调节补偿时,软件不能正确识别,甚至识别不出阳性群细胞。这时,我们可以选择该样本高表达的一些marker(CD3、CD4等),用相同的荧光标记来代替低表达marker。

注意事项

进行流式配色时,请尽量选择光谱重叠少的荧光素,减少补偿。

补偿值一般不会超过100%。如果出现超过100%的情况,可能是串联染料断裂导致;另外,补偿值不会出现负值,如果出现,则表示某些通道存在过补偿。

软件自动调节完补偿,可以打开补偿面板,观察一下每个通道的补偿是否合理。若不合理,可以适当进行微调。

为了更合理地圈出阴阳群,我们可以先根据FSC和SSC,圈出对应细胞群,这样更有利于调节补偿。

综上,正确且合理地设置单阳管,更便于后续对流式实验结果进行分析。

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