产品常见问题
为了提供更好的客户支持，解决客户关于流式抗体相关知识的疑问，我们整理并发布了关于流式抗体的最常见问题的解答（FAQs），并将持续更新。
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CD206是一个跨膜蛋白，在细胞膜表面和胞内均有表达。我们的抗小鼠的CD206流式抗体可与细胞膜表面及胞内的CD206结合，所以破膜或者不破膜都可以检测到，可根据实验设计选择是否破膜，一般推荐破膜检测。CD8和CD8α是免疫学中常用的标记分子，用于描述和鉴定免疫系统中的特定细胞类型。CD8是一种细胞表面受体分子，主要表达在细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和辅助T细胞亚群中。它起着重要的作用，通过与MHC-I分子结合，介导CTLs对感染细胞的识别和杀伤。因此，CD8通常被用作标记CTLs的一个指标。而CD8α则是CD8复合物的一个亚型，它是CD8的α链。CD8复合物由两个亚基（α链和β链）组成，其中CD8α链在形成复合物时发挥重要作用。CD8α链不仅参与与MHC-I分子的结合，也可以通过与其他信号分子相互作用来调节CTLs的活性。因此，CD8α的表达水平和功能状态在CTLs的活化和效应中起到关键作用。CD4(domain 1)并不是通常所指的CD4分子,CD4（cluster of differentiation 4）是一种免疫细胞表面分子，常用于鉴定和标记辅助T淋巴细胞（CD4+T细胞）。CD4蛋白由四个结构域组成，其中包括一个胞外域、一个跨膜域和一个胞内域。
在某些文献中，可以看到对CD4的特定结构域进行讨论和研究。CD4(domain 1)可能指的是CD4蛋白的第一个结构域，也称为D1域或者Ig-like V-type domain，这个结构域在CD4蛋白中起到与其他蛋白相互作用的重要作用。是的，CD44H是CD44的常见名称之一。CD44（cluster of differentiation 44）是一种免疫细胞表面分子，也被称为组织定位抗原（Hyaluronate receptor）。CD44蛋白通过其多个变异剪切形式（isoforms）的存在而具有多样性。其中，CD44H是CD44的标准形式，它是CD44的主要变异剪切形式。CD44H与细胞外基质的成分，如透明质酸（hyaluronan），相互作用，参与细胞黏附、迁移和信号传导等生物学过程。CD44H在许多细胞类型中广泛表达，并且在免疫细胞、肿瘤细胞和干细胞中都具有重要的功能。需要注意的是，不同的CD44变异剪切形式可能具有不同的功能和表达模式。因此，在特定的研究或实验中，可能需要进一步区分和研究特定的CD44变异剪切形式（如CD44v6、CD44s等）。是的，CD3由5种不同的链组成，即gamma、delta、epsilon、zeta、eta链。几乎所有抗CD3单抗都是针对epsilon链，epsilon链一般只表达在T细胞。不是的。CD45.1和CD45.2是免疫细胞表面的亚型标记形式，属于CD45（cluster of differentiation 45）家族的成员。CD45是一种受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，广泛表达在各种免疫细胞中，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等。CD45存在多个亚型，其中包括CD45.1和CD45.2。这两个亚型主要由CD45基因上的不同等位基因所决定。在实验中，通过引入CD45.1或CD45.2的基因等位型，可以用来区分不同来源的细胞。
表达CD45.1的小鼠品系包括FVB、RIII、SJL/J、STS/A、DA等，表达CD45.2的小鼠品系包括AKR、BALB/c、CBA/Ca、CBA/J、C3H/He、C57BL、C57BR、C57L、C58、DBA/1、DBA/2、NZB、SWR、129等。CD90，也被称为Thy1（thymus cell antigen 1），是一种小鼠免疫细胞表面分子。在小鼠中，CD90有两个主要亚型：CD90.1和CD90.2。这两个亚型之间的差别源于基因座上的等位基因差异。CD90.1和CD90.2是由不同的基因等位基因控制的表达变体。例如，在C57BL/6小鼠中，CD90.1表达受到Ly5.2基因座的调控，而CD90.2则由Ly5.1基因座控制。由于CD90.1和CD90.2的基因座差异，在实验中可以利用这些亚型进行标记以区分不同来源的细胞。通过引入CD90.1或CD90.2的基因等位型，可以对细胞进行遗传标记，从而识别、追踪和定量分析特定来源的细胞。
CD90可表达于造血干细胞、神经元、所有胸腺细胞、外周T细胞上。表达CD90.1的小鼠品系包括AKR、BDP、MA/MyJ等，表达CD90.2的小鼠品系更多，包括Balb/c、CBA/J、C3H/He、C57BL/-、DBA、NZB/-等。CD45是一种受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，也被称为cluster of differentiation 45，通过调节蛋白酪氨酸磷酸化水平来影响多个信号通路，包括T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）等。CD45广泛存在于造血系统细胞膜表面，在所有的白细胞上都有表达。根据其胞外去表位的不同已发现6种异构体分子，在人细胞表面鉴定出3种，CD45RA、CD45RB、CD45RO。应用这种异构体分子可将T细胞分为2个新亚群。凡未经抗原刺激的T细胞可称为原始T细胞（Naive T cell, Tn），为CD45RA+ T细胞群。经过抗原刺激分化的为记忆T细胞（memory T cell, Tm），为CD45RO+细胞群。CD62L, CD62E, CD62P是两种免疫细胞表面分子，属于选择素家族的成员。
CD62L，也被称为L-选择素（L-selectin），是一种整合素家族的蛋白质，主要表达在白细胞表面。它参与调节白细胞的黏附和迁移，特别是在炎症和免疫应答中起重要作用。CD62L通过与其配体（如血管内皮细胞上的PECAM-1）结合，帮助白细胞从血液循环中滚动并定向迁移到炎症部位或淋巴结等区域。
CD62P，也被称为P-选择素（P-selectin），是一种黏附分子，主要表达在内皮细胞和血小板上。在炎症和血栓形成等过程中，内皮细胞上的CD62P能够快速表达，并与白细胞上的配体（如PSGL-1）结合，促进白细胞和血小板的互相黏附和激活。
CD62E，也被称为E-选择素（E-selectin），是一种黏附分子，主要表达在内皮细胞上。克隆号是不一样的。克隆号表示抗体筛选自某一株细胞。克隆号一致的抗体，针对的抗原表位完全相同。这两个抗体都是能够使用的。大多数老师做小鼠巨噬细胞会用F4/80、CD11b确定总巨噬细胞，然后用CD86测M1型，CD206测M2型，但是最终客户要检测哪些指标还是需要客户根据文献以及自己的实验需求自己来决定的，以上可以作为一个参考。小鼠NK细胞鉴定，需要根据小鼠品系来选择CD3-CD49b+或者CD3-NK1.1+，如BALB/c小鼠用CD49b(DX5)，C57BL/6小鼠用NK1.1。其他品系建议使用CD49b。有红细胞的样本，需要用到红细胞裂解液，裂解红细胞（E-CK-A105）；
Fc受体丰富的细胞如巨噬细胞，在加入流式抗体前需要先封闭FC受体，以减少抗体的非特异性结合，目前我司只有人和小鼠的封闭剂，E-AB-F1236A Purified Anti-Human CD16 Antibody[3G8] ，E-AB-F0997A Purified Anti-Mouse CD16/32 Antibody[2.4G2]。
细胞染色过程中需要使用细胞染色缓冲液（E-CK-A107）；
胞内指标的检测需要针对胞内指标检测的固定破膜液（E-CK-A109），核内指标的检测需要针对核内指标检测的固定破膜液（E-CK-A108）；
对于肿瘤等组织样本进行流式检测的时候，还会用到死细胞染料。巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞等等会表达Fc受体的，在流式实验抗体染色过程中，抗体Fc段会与细胞表面的Fc受体进行结合，从而产生非特异性的染色结果，以及使用含花青素的染料，如PE/Cy7标记的抗体也会有非特异性的染色结果，最终导致流式实验结果中有假阳性的存在。可以不用洗直接孵育抗体。使用方法是：100 μL体积细胞悬液（1x10^6 cells）中加入0.5-1 μg，即1 μL-2 μL，室温下孵育10分钟。像巨噬细胞这种Fc受体丰富的细胞建议加2 μL进行封闭。细胞染色缓冲液主要作用可以保持细胞活力，使细胞变得稳定并且对损伤不太敏感；使pH敏感荧光染料产生的荧光信号强度最大化；减少抗体与靶细胞的非特异性结合；螯合金属阳离子，减少细胞之间的粘连。可以用1%BSA的PBS溶液替代。一个样本大概需要1.5 mL细胞染色缓冲液。空白对照：用来设定各个通道的电压。
同型对照：同型对照抗体作为阴阳性细胞的断定依据，尤其是低表达或连续表达的指标，数据分析的时候不好圈门，同型对照抗体是必不可少的对照。
单染管对照：流式多色实验中，如果各个通道的荧光之间有干扰，需要单独做每个荧光的单染管用来调补偿。
FMO对照：FMO对照又称为荧光减一对照，指的是多色实验时，要检测某个荧光通道的表达情况，由于荧光渗漏影响占主要，所以检测时先将该通道的抗体去掉，检测一下其它通道漏到此通道的背景荧光水平，进行正确排除，从而帮助设门。
我们在官网上有详细说明，点击此处跳转查看同型对照抗体用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体等而产生的背景染色，能够作为阴阳性细胞的判断依据，尤其是低表达或连续表达的指标，数据分析的时候不好圈门，同型对照抗体是必不可少的对照。
同型对照是与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤由未免疫动物血清纯化而来。
我们在官网上有详细说明，点击此处跳转查看Test包装的抗体我们在细胞模型上验证时对抗体的使用量做过滴度摸索和优化的，所以是不需要稀释的。一管细胞样本{100μL的细胞悬液（1x10^6个细胞）}加入1 Test（5μL）的抗体就可以了。Test包装的抗体在细胞模型上对抗体的使用量做过滴定摸索和优化的，而μg包装没有对抗体的使用量做过滴定摸索和优化实验，所以需要根据已知的抗体浓度以及细胞样本情况做抗体滴定实验去摸索最优的抗体使用量。抗体用量跟孵育体系有关，如果细胞悬液体积仍然是100 μL的话，抗体用量是不变的，若想节省抗体用量可以减小细胞悬液体积，抗体用量可以按比例减少。建议使用推荐的细胞量进行实验，若细胞数量过多，会导致抗体用量不够，造成假阴性，若细胞量太少的话，尤其是在做胞内或者核内指标时，大量的离心操作会损失很多细胞，导致最终检测的细胞数量不够。应该标记后的流式抗体因其偶联的荧光素不同，其稳定性也有差异，建议通过预实验来验证冻融后的抗体后再确定，比如FITC的稳定性优于串联染料，无论何种荧光素，都应避免反复冻融。抗体在运输过程中，抗体会因为颠簸沾到管壁管盖上，所以收到抗体后适度离心一下将管壁管盖上的抗体收集至管底，避免抗体有所损失。宿主物种指的是抗体来源的种属信息；物种反应性指的是经实验验证，能与我们的抗体产生特异性结合的种属。建议使用离心机的离心力不超过300g，离心升速不超过3，降速不超过1，避免细胞受到损伤。抗猪的二抗以及针对酵母工程菌的抗体，我们没有。免疫分型检测细胞因子时会使用CD4 [SK3]和CD4 [RM4-5]。因为①PMA刺激导致CD4发生内吞，克隆号为SK3和RM4-5的CD4对内吞影响比较小。②检测细胞因子时样本需要固定，SK3和RM4-5的CD4结合域受固定剂影响较小。大多数做小鼠巨噬细胞分选会用F4/80、CD11b确定总巨噬细胞，然后用CD86测M1型，CD206测M2型，以上只作为一个参考。如果流式分选得到的细胞还需进行培养，建议不要使用CD206，因为CD206需要进行固定破膜操作，细胞会全部死亡。此外，M1和M2的标志物表达量不高，很难分选。建议老师加上CD45、CD11b和死活染料。一方面，肿瘤样本中细胞种类多且巨噬细胞比例较低，很难找到目标群。另一方面，死细胞容易摄取抗体和探针，导致明显的非特异性染色，而且死细胞自发荧光特别强，会导致背景荧光增强，使得我们无法观察到一些标记的弱阳性表达。所以建议老师通过死活染料排除死细胞干扰，然后圈CD45阳性找到目的细胞群，最后通过CD11b和F4/80确定巨噬细胞比例。主要用到的化学试剂有0.1M PBS, EDTA二钠，NEM , 另有还原剂DTT或2-MEA，或TCEP ，还需要10kD超滤管或者脱盐柱。
根据抗体的特征，假定抗体是常规杂交瘤单克隆抗体（例如mouse IgG 2a ,150kDa），抗体在中性缓冲液（例如PBS+ EDTA,PH7.2）中，使用合适的量的DTT或者2-MEA 使其还原，暴露出-SH(巯基)，再将SMCC活化的染料加入到还原后的抗体（按照一定比例）中， 37℃或者4℃过夜混合反应，后添加化学试剂盒例如NEM（N-Ethylmaleimide） 封闭反应 0.5 h左右,即完成标记；后续可根据实际情况确定是否进行进一步纯化操作。
另外也可以使用SATA，或者2-亚氨基硫烷盐酸盐处理抗体，后续再加入相关试剂（SATA需要盐酸羟胺等）激活出-SH(巯基), 再将SMCC活化的染料加入到活化的抗体（按照一定比例）中， 37℃或者4℃过夜混合反应，后添加化学试剂盒例如NEM（N-Ethylmaleimide） 封闭反应也是可以，这种方式不会将抗体还原，但是可能会干扰抗原抗体结合位点，步骤也比较繁琐一些。
具体选择哪种方式需要根据抗体的类别和特性来定。荧光染料的使用比例也需要设定预实验去摸索。该裂解液不建议用于禽类。禽类的红细胞和人或小鼠有较大差异。可以，室温（20℃至25℃）裂解。建议客户使用胞内因子固定破膜剂，货号为E-CK-A109。CD16/32是特异性封闭剂，效果更好。Fc受体是细胞表面的CD16和D32蛋白，还有CD64，但是CD64是与FcR是强结合性的，不用特异性的抗体也能很好的结合。不行，建议使用超纯水、双蒸水、三蒸水或去离子水稀释。细胞染色缓冲液稀释破膜剂后会改变样本本身的渗透压以及盐粒子浓度，最终导致细胞状态变差甚至死亡。我们没有验证过这款裂解液对其他细胞活力的影响。目前在外周血中，我们主要研究的研究对象还是白细胞。这款裂解液在正常情况下对白细胞影响不大。在《流式课堂|流式实验该准备多少管样本?如何设置对照? 》这篇文章中，我们建议使用FMO联合同型对照作为阴性对照去圈门，但FMO联合同型对照比较复杂，所以许多实验者会选择一种简单的方法——只使用同型对照作为阴性对照去圈门。同型对照用于消除抗体的非特异性结合而导致的背景染色，以帮助找到真正的阴性细胞群。同时检测多个样品时，只需要设置一个同型对照。但如果进行多个实验，每次都需要设置同型对照。表达量低或分群不太明显的指标建议做FMO联合同型对照（FMO-ISO），只需要做一管。以IFN-γ为例，以“预期IFN-γ表达较多的组的样本”作为FMO-ISO的样本，加入除IFN-γ外的其他流式抗体和IFN-γ的同型对照抗体，这一管样本称为FMO联合同型对照管。其余实验步骤与实验组一致，如死活、固定破膜等。封闭剂是液体，不需要加入溶剂溶解。μg包装的抗体需要做预实验对抗体进行滴定。我们没有做相应的滴定摸索，需要根据说明书的推荐用量、已知的抗体浓度以及自己细胞样本情况做抗体滴定实验去摸索最优的抗体使用量，所以无法给出具体的使用次数。
一般来说，一次实验每种抗体的使用次数是单染管一次，各个全染管分别加一次（有生物学对照和实验组），也就是说，一次实验每种抗体至少需要加3次。死细胞的自发荧光会很强烈，如果不用死活染料排除死细胞，可能会在分析结果的散点图中出现沿着对角线分布的细胞群，影响实验结果。所以为了确保实验结果的准确性，对于除脾脏外的组织样本，一般建议加死活染料来排除死细胞。如果是血液样本，如果样本新鲜，并且只做少数几个细胞表面染色的多染，也可以不排除死细胞，但这需要预实验确定样品中死细胞不多或者不会对结果造成干扰。
可通过对现有数据的死细胞群体进行分析，看看这些细胞在荧光通道的分布以及对应的比例是不是和活细胞群体基本一致，如果一致，可以不做死活细胞染色，不一致的话，建议加上活死染料。准备两管细胞流式上机，分别是对照组细胞和处理组细胞的空白管。上机时把所有荧光通道打开，看哪个通道有阳性信号，通过判断样本的干扰通道确定药物的荧光。建议直接将活体组织放在1%BSA的PBS、RPMI1640培养基或专用的组织保存液中浸泡，4℃可保存24h，最好尽快实验。建议老师提前做预实验验证一下。抗体用量主要是和液体体积和细胞数量有关。细胞量少的话可以将整个体系减半孵育，就是50ul 细胞悬液+2.5ul流式抗体。但是如果该样本目的细胞很少的话，细胞量也减少可能会对结果有影响，导致只能检测到很少的信号。红细胞裂解液不能去除血小板，血小板密度小，所以细胞离心后，血小板处于样本上清中，可通过弃上清去除血小板。建议不要，因为钙镁离子会抑制酶活性。虽然目前市面上绝大部分的酶试剂中会添加EDTA来螯合钙镁离子，但还是建议您最好使用不含钙镁离子的HBSS。另外，如果后续的检测指标里有与钙离子相关的指标也建议使用不含钙镁离子的HBSS，如检测钙离子内流。如果后续的检测指标里有需要刺激活化的指标，还要注意使用的酶里不含EDTA，如活化的T细胞产生的IFNγ（因为EDTA会螯合钙离子，而钙离子是保证T细胞活化过程的重要微量元素）。①选择肝素抗凝管；②样本制备：a.人外周血样本：提前稀释红细胞裂解液，现配现用；b.PBMC样本：将样本及试剂复温到18~20℃以后再进行实验；实验环境温度控制在18~20℃；收集的新鲜人血尽量在1 h内进行PBMC分离; 加入血液时，避免冲散分层液面；加完后不要混匀或晃动管。③采血过程中，血样在肝素抗凝管中充分摇匀，避免血凝（肝素抗凝管保存时间一般不要超过12h）；④裂红时间不超过5min，建议做预实验摸索一下最佳时间；⑤无菌操作；⑥刺激和阻断时间建议通过预实验摸索。①所有样本管均需与实验组一样进行固定破膜，如blank对照，单标组，fmo-iso；②各组固定破膜时间尽量不要相差太久，如果样本量多，建议分批次操作；③对于肿瘤组织样本，由于检测目的细胞量少，需考虑增加抗体用量，上机时间数至少100万个；④建议增加75um微米孔径滤网进行二次过滤，提高免疫细胞纯度和含量；⑤由于刺激阻断时间较长，需要在刺激阻断时间结束前注意无菌操作。
参考资料：
①血样胞内因子实验注意事项的直播回放：https://www.elabscience.cn/resource-flow_cytometry-detail-965。
②肿瘤组织单细胞悬液的制备方案：https://www.elabscience.cn/resource-flow_cytometry-detail-261。这两种样本制备的顺序都是可以应用的。先裂红再染色可以减少杂细胞，使抗体和抗原的特异性结合效率更高；而先染色再裂红可以减少离心次数，可以更大程度地保留细胞数，更适合细胞量少的样本或珍稀样本。另外，先染色再裂红可能会影响某些指标的表达，如CD122、CD200、CD56、CD183、IGM等。这些指标建议先裂红再加抗体，染色效果会更好。客户可以根据自己的情况选择最合适的方法。如果研究的指标里就含有FcR（如FcrRII/III），那么需要先孵育anti-FcrRII/III antibody流式抗体，再孵育FcR封闭剂，最后孵育其他抗体。流式实验建议用新鲜细胞做。如果您这边情况特殊，只能建议您先将制备好的单细胞悬液用4%多聚甲醛固定30min，然后用PBS洗涤两遍，保存在细胞染色缓冲液（可以用1 %BSA的PBS替代）中，置于4°C保存，试剂收到后尽快检测。后续需要进行细胞培养操作的实验都需要使用无菌耗材，如胞内因子检测或流式分选实验。
