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TUNEL检测细胞凋亡原则及经验总结

TUNEL检测细胞凋亡原则及经验总结

2019-07-10作者:admin赞:1

一、TUNEL法的实验原理

细胞发生凋亡时, 染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。由此,TUNEL成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。(TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(增强型,绿色荧光)为例)


TUNEL检测:使用20 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟。


二、TUNEL实验中关键步骤

1.充分脱蜡和水化。脱蜡前可先将切片在 60ºC烤片 20 min,再使用二甲苯脱蜡2次,每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,便于后期试剂能充分、均匀的结合反应。

2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用 10-30 min,几 μm 厚的切片用短时间;几十 μm厚的 切片用长时间,通过摸索达条件使实验过程做到既不脱片,也能够使后面的酶或抗体进入胞内。

3.适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是37ºC孵育 1 h,也可以根据细胞的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至 2 h,但要结合实验最终的背景着色来确定。

4.DAB 显色条件的选择。如果是用DAB显色,一般 DAB 反应不超过10 min,可结合显微镜观察控制背景颜色,有可能几十秒种就能显色

5.PBS 的充分清洗。在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗请严格遵守清洗条件,次数可增加到 5 次,以降低切片的非特异性着色。

6. 内源性 POD 的封闭。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,可适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到较好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。


三、细胞通透的时间选择

1.蛋白酶 k 的目的是通透细胞膜和核膜,从而使反应试剂能充分进入细胞核进行反应,提高阳性率。但浓度过高或孵育时间过长容易造成脱片,其作用类似与 TritonX100 等细胞通透剂。

2. 蛋白酶K一般工作液浓度为 20 μg/ml,亦可自行将浓缩液配制1-10 mg/ml。蛋白酶K可用 PBS 配制,也可用蛋白酶K缓冲液(100 mM Tris HCl pH8.0, 50 mM EDTA),分装后-20ºC保存。

3. 蛋白酶K反应时间一般为10-30 min,具体时间长短与切片厚薄有关,4 μm左右的片子可以通透 10 min,如切片厚度30 μm左右的可延长至30 min,需实验摸索最佳时间。通透时间过长易脱片、过短起不到通透效果。


四、关键试剂操作条件

1. DAB 显色反应大约需要30s-5 min,要控制好反应时间,勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒说明摸索条件。

2. 蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索,温度过高,时间过长,易造成脱片且可能破坏核酸结构,出现假阳性。

3. 阳性样本的DNase 1处理一般建议室温,10 min 即可。


五、如何减弱非特异性染色

肝脏或肾脏,因富含内源性过氧化物酶,需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短 DAB 孵育时间、PBS 充分清洗,显微镜下把握好着色情况。


六、常见问题分析

现象

可能原因

建议

非特异性染色

TdT酶的浓度过高

TdT dilution buffer* 12110稀释

TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。

注意控制反应时间,并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。

光照紫外线导致包埋试剂的聚合(如:甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂)

尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂

在固定组织时样本DNA已断裂(内源核酸酶的作用)

确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定

使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液

采用推荐的固定液

固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂

用含有dUTP dAPT的溶液封闭

标记率低

如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失)

用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定

或福尔马林或戊二醛固定。

固定时间过长,导致交联程度过高

减少固定时间,或用溶于PBS PH7.42%多聚甲醛固定

荧光淬灭

Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭,需注意避光操作

促渗条件不佳,以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低

1、增加通透剂促渗时间

2、增加通透剂的作用温度(15-25℃)

3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间(如:以400ug/ml作用5min

40.1M的柠檬酸钠70℃作用30min

荧光背景很高

支原体污染

请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染

TdT酶的浓度过高或反应时间过长

TdT dilution buffer* 12110稀释或注意控制反应时间

红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。

高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂。

宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。

阳性对照没有信号

DNase I的浓度过低

1、冷冻切片使用3u/mlDNase I

2、石蜡切片使用 1500u/mlDNase I

3、一般样本使用10u/ml DNase I

组织样本从载玻片脱落

组织样本被酶从玻片消化下来

降低蛋白酶K的处理时间



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