TUNEL检测细胞凋亡原则及经验总结

一、TUNEL法的实验原理

细胞发生凋亡时, 染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。(以TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(增强型，绿色荧光)为例)

TUNEL检测：使用20 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟。

二、TUNEL实验中关键步骤

1. 充分脱蜡和水化。脱蜡前可先将切片在 60C烤片 20 min，再使用二甲苯脱蜡2次，每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，便于后期试剂能充分、均匀的结合反应。

2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 厚的切片用短时间;几十 μm厚的 切片用长时间，通过摸索达条件使实验过程做到既不脱片，也能够使后面的酶或抗体进入胞内。

3. 适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是37C孵育 1 h，也可以根据细胞的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合实验最终的背景着色来确定。

4. DAB 显色条件的选择。如果是用DAB显色，一般 DAB 反应不超过10 min，可结合显微镜观察控制背景颜色，有可能几十秒种就能显色。

5. PBS 的充分清洗。在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗请严格遵守清洗条件，次数可增加到 5 次，以降低切片的非特异性着色。

6. 内源性 POD 的封闭。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，可适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到较好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

三、细胞通透的时间选择

1. 蛋白酶 k 的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂能充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间过长容易造成脱片，其作用类似与 TritonX100 等细胞通透剂。

2. 蛋白酶K一般工作液浓度为 20 μg/ml,亦可自行将浓缩液配制1-10 mg/ml。蛋白酶K可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K缓冲液(100 mM Tris HCl pH8.0, 50 mM EDTA)，分装后-20C保存。

3. 蛋白酶K反应时间一般为10-30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 μm左右的片子可以通透 10 min，如切片厚度30 μm左右的可延长至30 min，需实验摸索最佳时间。通透时间过长易脱片、过短起不到通透效果。

四、关键试剂操作条件

1. DAB 显色反应大约需要30s-5 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒说明摸索条件。

2. 蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易造成脱片且可能破坏核酸结构，出现假阳性。

3. 阳性样本的DNase 1处理一般建议室温，10 min 即可。

五、如何减弱非特异性染色

肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短 DAB 孵育时间、PBS 充分清洗，显微镜下把握好着色情况。

六、常见问题分析