小鼠腹水及单细胞悬液制备及注意事项

小鼠腹水及单细胞悬液制备流程

1. 配制6%淀粉肉汤。

6%淀粉肉汤配制方法：牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 1.0 g、氯化钠 0.5 g、蒸馏水 100 mL，上述材料混合加热后加入可溶性淀粉6.0 g；溶解后，121℃高压灭菌15~20 min，EP管分装封口，将肉汤放置于4℃保存。

2. 小鼠腹腔注射1 mL 6%淀粉肉汤（注意避开肠管和内脏），刺激60~72 h。

3. 颈椎脱臼法处死小鼠，用75%酒精浸泡小鼠5 min。

4. 将小鼠置于解剖板中，固定四肢，剪开皮肤，充分暴露腹膜。

5. 用眼科镊子提起腹膜，用5 mL 注射器往小鼠腹腔注射2.5 mL预冷PBS（勿扎到脏器），轻揉小鼠腹部1~2 min。注射器回抽腹腔灌洗液，收集于15 mL离心管中。

6. 重复第5步5次，冲洗腹腔，可观察到冲洗液逐渐澄清。

7. 将收集的腹腔灌洗液300 g离心5 min，弃上清。

8. 用细胞染色缓冲液或者含10%胎牛血清的1640培养液重悬细胞。

9. 进行细胞计数，并调整细胞浓度至1×10⁷/mL。

小鼠腹水FSC/SSC图

注意事项：

1. 若第7步离心弃上清后发现细胞沉淀中有较多红细胞，且检测目的细胞非红细胞，先加入适量红细胞裂解液裂解红细胞（可加入500 μL 1×红细胞裂解液重悬细胞，室温裂解2 min后，立马加入10 mL PBS，300 g离心5 min后弃上清）。

2. 若提取的腹腔巨噬细胞需培养，请注意无菌操作。

3. 收集腹水时，从小鼠左侧（肠道较多）注射PBS，从右侧（器脏较大）抽腹腔灌洗液，注意不要扎到器脏。

4. 小鼠腹腔灌洗液收集细胞比较脆弱，加细胞染色缓冲液有利于细胞的保存，但建议当天及时检测。

5. 小鼠腹腔灌洗液中大多数为巨噬细胞，巨噬细胞检测需要封闭Fc受体，此时可使用小鼠CD16/32纯抗[E-AB-F0997A]进行封闭：往100 μL（细胞数1×10⁶）细胞悬液中加入1 μg纯抗，室温封闭15 min，直接加入流式抗体进行后续实验。

6. 巨噬细胞检测应尽量避免使用含花青素的流式抗体（如PE-Cy7），会增加非特异性染色。若为非巨噬细胞检测，使用含花青素的流式抗体（如PE-Cy7）时也需要封闭。