Annexin V的常见问题分析及解决方案

Source: Elabscience^®Published: 2024-02-07

Annexin V染色法是检测细胞凋亡的方法之一。我们常将荧光染料标记的 Annexin V与Propidium iodide(PI)/7-AAD/DAPI搭配使用，通过流式细胞仪区分正常细胞、凋亡早期和凋亡晚期细胞。

本期流式课堂，带大家一起分析总结Annexin V实验中常见的失败原因和优化方案，快来看看有没有你遇到的问题呢？

1.细胞碎片比例过高

可能原因	解决方案
胰酶消化过度	待大部分细胞开始皱缩变圆、细胞间隙增大时，及时加含血清的培养基终止消化；部分难消化下来的细胞可分批多次消化
Annexin V Binding Buffer(10×)未稀释	重新配制1×Annexin V Binding Buffer
细胞本身状态不佳	优化细胞培养条件，调整细胞状态
实验操作带来的机械损伤	温柔处理细胞。避免移液器直接接触细胞；注意离心“缓升缓降”等

2.空白组有荧光信号

3.正常细胞出现大量凋亡

可能原因	解决方案
细胞状态不佳	调整细胞状态，重新培养细胞
实验操作带来的机械损伤，或细胞消化过度	温柔处理细胞
染色时间过长（细胞长时间处于非正常生长环境会导致细胞凋亡）	控制好实验时间，如果样本太多，可以分批进行实验
Annexin V Binding Buffer(10×)未正确稀释	重新配制1×Annexin V Binding Buffer

4.缺少早期凋亡

可能原因	解决方案
药物处理或加入溶剂浓度过高，或加入药物未及时混匀导致局部浓度过高，使部分细胞出现被固定的效果，改变了细胞膜通透性	调整加药方式和浓度
药物处理时间过长，药物浓度偏低(耐药强的细胞基本不受影响，不耐药的细胞进入凋亡晚期或被破坏成为裸核形态）	缩短药物诱导时间，适当提高加药浓度

5.缺少晚期凋亡

可能原因	解决方案
核染料忘记添加	重新实验，注意添加核染料
细胞确实没有晚凋和裸核	重新调整细胞处理条件，可以借助显微镜观察细胞是否凋亡
阈值设置过大，没有收集到凋亡信号	调整仪器设置，降低阈值
贴壁细胞培养上清中的细胞没有收集	收集上清中的细胞

6.分群不明显

可能原因	解决方案
荧光物质干扰（如：转染、药物、细胞本底荧光）	优先选择调整补偿，如果难以调节，建议更换其他荧光标记的试剂盒，或者用其他物质处理细胞
细胞状态较差，所有细胞都有一定的PS外翻	培养、实验过程都需要温柔对待细胞
细胞数量太多，染料相对不足	按照孵育体系处理样本

7.处理组凋亡率过低（小于10%）

8.实验组中存在斜向上的细胞群

可能原因	解决方案
荧光染料间的补偿调节不合适	建议做单染管，调节补偿。
荧光物质干扰（如：转染、药物、细胞本底荧光）	优先选择调整补偿，如果难以调节，建议更换其他荧光标记的试剂盒，或者用其他物质处理细胞