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细胞带有GFP荧光时,如何进行流式凋亡分析?

Source: Elabscience®Published: 2022-09-15

随着生物研究进入基因时代,转染技术的应用越来越广泛。在此过程中,通常会引入GFP(绿色荧光蛋白)标签,去验证转染是否成功。

在之前的流式课堂中,我们曾多次提到过流式配色问题。今天,就来带大家看看,带有GFP标签的细胞,在流式凋亡检测中,应该如何配色和分析结果。


一、如何选择试剂盒

挑选试剂盒时,需要选择干扰少的荧光组合。GFP的激发/发射波长为488/510,通常在流式细胞仪中的检测通道为FL1。因此,我们不能选择荧光标签为FL1检测通道的凋亡检测试剂盒,如AF488、FITC、EGFP等。

在这里,比较推荐的荧光组合是Annexin-V APC/7AAD。APC的激发/发射波长为650/660,7AAD的激发/发射波长为546/650,可以很好地降低GFP带来的干扰,使结果分析更加准确。

GFP/7AAD/APC波谱图

流式凋亡分析


二、如何分析结果

在选择了合适的试剂盒进行上机检测后,恰当的结果分析,对于数据的完美呈现,也是至关重要的。以前文数据为例,我们来看看如何分析:


01 设置FSC/SSC圈门

根据大小及颗粒度,圈出需要分析的细胞群体,排除碎片及黏连体的影响;

FSC/SSC圈门图

02 调整荧光补偿

通过荧光波谱图,可以看出Annexin-V APC/7AAD组合与GFP波谱的重叠区域很小,但仍存在部分重叠。为了使结果更加准确,需要进行荧光补偿调节;

调节补偿后

                             调节补偿前                                                                调节补偿后


03 划定十字门,得到最终凋亡结果

经过以上步骤,从图中可以看出,最终的实验结果是较为理想的。

最后总结一下,带有GFP荧光的细胞进行流式凋亡检测的注意事项:

1.  选择荧光干扰少的检测试剂盒;

2.  合理的圈门;

3.  正确调整荧光补偿。


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