酶类生化试剂盒注意事项

1. 催化特点

① 高效性

② 专一性

键专一、基团专一、绝对或几乎绝对专一

③ 可调节性

酶浓度调节、激素调节、共价修饰调节、限制性蛋白酶的水解作用与酶活调节、抑制剂的调节、反馈调节、金属离子和其他小分子化合物的调节。

2. 影响酶活因素

①. 酶活测定方式

测定酶活，必须了解酶催化反应总的反应式，而且分析程序必须能够测定底物的消失或产物的生产。还需考虑辅助因子、酶的最适pH值和最适温度。

②. 酶联测定法

过氧化物酶和它的共底物或辅酶必须过量，使酶联测定不属于限速步骤。

③ 酶反应速率

④.底物浓度：酶被饱和

⑤. 酶浓度

⑥. 温度

⑦. pH值

3. 酶的提取

①. 破碎方法

机械匀浆法、超声波法、冻融法、渗透压法、酶消化法。

②. 冻融液

需加入蛋白酶抑制剂PMSF、配合剂EDTA、还原剂DTT等防止破坏目的酶。

③. 酶消化法

利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破裂。

4. 酶失活原因

1. 蛋白酶水解和自溶作用

酶在使用和储藏过程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的结果。

2. 聚合作用

3. 极端pH值

4. 氧化作用——氧分子、过氧化氢、氧自由基

5. 表面活性剂和去污剂

6.变性剂——脲和盐酸胍、高浓度盐、螯合、有机溶剂

7. 重金属离子和巯基试剂

8. 热

9. 机械力

10. 冷冻和脱水

11. 辐射

5. 酶活计算

① 酶活定义

酶的活力单位：酶的1个活力单位是在该酶的最适条件下，在25℃、1 min内催 1μmol的底物转化为产物的酶量。

② 定时法的计算

将酶与底物在特定条件下孵育，酶促反应开始进行，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度或产物生成速度，将速度换算为μmol/min即是以国际单位表示的酶活性。

例如:

假设某一样品种的酶活性记为X U/L，取样品量VS(mL)与底物缓冲液Vr(mL)孵育，t min后加入终止液Ve(mL)，检测到的净吸光度增加为A，该产物的摩尔消光系数为ε(一般可通过带标准求得)，比色皿光径为 b cm。

③ 连续监测法计算

酶与底物在特定条件下孵育，每隔一定时间(2-60 s)连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。连续监测法是在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量，选取线性期的速率来计算酶活性，又称速率法。

例如:

假设某一样品种的酶活性记为X U/L，取样品量VS(mL)与底物缓冲液Vr(mL)孵育，延滞期为t0 min，测定时间间隔为t1 min，读数次数为n，每间隔时间吸光度变化平均值为A1，该产物的摩尔消光系数为ε(一般可通过带标准求得)，比色皿光径为b cm。反应速度分别用产物的生成速度和样品中酶的催化能力来表示：

令：