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小鼠骨髓来源树突状细胞的培养和鉴定

Source: Elabscience®Published: 2024-06-26

树突状细胞(Dendritic Cells, DC)来源于骨髓,是功能最强大的抗原递呈细胞,在先天免疫和后天免疫系统之间起着通道的作用。DC细胞是唯一能够显著刺激初始T细胞(NAIVE T细胞)增殖的APC(Antigen Presenting Cells,抗原呈递细胞),其他APC(如B细胞和单核巨噬细胞等)仅能刺激已活化的效应T细胞或记忆T细胞。DC细胞是机体T细胞适应性免疫应答的始动者,在肿瘤免疫中发挥着重要的作用。

虽然DC存在于体内多种组织中,但含量很少,无法满足科研和临床治疗的需求,需要在体外培养和扩增DC。对于小鼠,常用的方法是从骨髓细胞诱导获得DC,即骨髓来源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells,BMDC)。

常见的小鼠BMDC制备方法有Sons法、Lutz法、Inaba法(改良),但培养过程复杂,需要多条件反复测试验证才能保证细胞得率和纯度。Mouse Bone Marrow-derived Dendritic Cells (BMDC) Differentiation and Culture Kit含有小鼠骨髓细胞DC分化培养试剂和DC促成熟试剂,提供了一套操作简便的BMDC分化培养和鉴定方案,使BMDC细胞的获得更便捷,主要流程包含以下内容:

图1. BMDC分化培养和鉴定流程

1

试剂准备和样本准备

01


BMDC全培养基的配制

在RPMI 1640基础培养基中(PM150114,Pricella®),加入终浓度为2 mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液、终浓度为100 U/mL的青霉素溶液、终浓度为100 μg/mL的链霉素溶液和终浓度为10%的特优级胎牛血清,配制好后4℃分装保存,1个月内使用完毕。  

02


BMDC分化培养基的配制

使用BMDC全培养基稀释Mouse DC cell Differentiation MIX(1000X)到1X,即50 mL BMDC全培养基中加入50 μL Mouse DC cell Differentiation MIX(1000X),轻轻吹打混匀。配制好后4℃保存,2周内使用完毕。

03


BMDC成熟培养基的配制

使用BMDC全培养基稀释Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X)到1X,即50 mL BMDC全培养基中加入50 μL Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X),轻轻吹打混匀,即为BMDC成熟培养基。配制好后4℃保存,2周内使用完毕。

04


1X ACK Lysis Buffer的配制

取出4℃预冷的10X ACK Lysis Buffer(预先使用0.22 μM滤膜过滤除菌)和无菌去离子水,每900 μL无菌去离子水中加入100 μL 10X ACK Lysis Buffer,轻轻吹打混匀。配好的1X ACK Lysis Buffer 4℃预冷保存,24h内使用完毕。

05


小鼠骨髓细胞单细胞悬液制备

无菌环境制备小鼠骨髓细胞单细胞悬液。

2

BMDC的分化培养

01


第0天

使用BMDC分化培养基调整细胞密度到5×105cells/mL后,接种细胞到培养皿中,于 37℃ 5% CO2培养箱培养。

02


第1天

每皿细胞补加二分之一体积的BMDC分化培养基,轻轻晃动培养皿混匀,镜下观察细胞状态并拍照。

03


第3天

收集悬浮及疏松贴壁的细胞,150 g离心3 min,小心弃去上清。使用BMDC分化培养基重悬细胞沉淀,调整细胞密度到5×105cells/mL,接种细胞到新的培养皿中,于 37℃ 5% CO2 培养箱继续扩增培养。

04


第 5天

收集悬浮及疏松贴壁的细胞,细胞计数后,150 g离心3 min,小心弃去上清。使用BMDC分化培养基重悬细胞沉淀,调整细胞密度到5×105cells/mL,接种细胞到新的培养皿中,于 37℃ 5% CO2 培养箱继续扩增培养或进行下游实验。

05


第 5~7 天

细胞培养至第 5~7 天已形成不成熟的DC细胞,可根据实验目的,收集细胞进行计数,进入下游实验或继续诱导成熟。

注:在第5~7天的细胞扩增培养期,细胞增殖很快。若需继续培养,可观察细胞培养密度和状态。若培养基变色明显,细胞聚团较多,可每24 h补充二分之一体积的分化培养基,每48 h全换液,为细胞增殖提供充分的营养和生长环境,延长培养时间有利于增加DC细胞的纯度,DC细胞纯度可达70~80%。

3

BMDC的成熟培养

01


收集培养第5~7天的悬浮及疏松贴壁的细胞,细胞计数后,150 g离心3 min,小心弃去上清。使用BMDC成熟培养基重悬细胞沉淀,调整细胞密度到5~8×105cells/mL,接种细胞到新的细胞培养皿中,于 37℃ 5% CO2培养箱继续培养24 h。

02


收集悬浮细胞及疏松贴壁的细胞(此时为成熟的DC细胞),计数,进行表型鉴定或进入下游实验。

4

BMDC的鉴定

收集未成熟或成熟的DC细胞,加入流式抗体进行检测。

图2. 未成熟DC(左)细胞有少量树枝状突起,细胞聚团较少;成熟的DC细胞(右)树枝状突起增多,细胞聚团较多。

图3. 7 周龄雄性 C57/BL6 小鼠,骨髓细胞分化培养7天和7天分化后促成熟培养1天的流式对比检测图。

5

相关鉴定抗体和试剂

产品名称

货号

厂家

Mouse DC Cell Differentiation MIX(1000X)

XJM003A

Elabscience

Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X)

XJM003B

Elabscience

PerCP Anti-Mouse MHC II (I-A/I-E)Antibody[M5/114]]

E-AB-F0990F 

Elabscience

Elab Fluor® 488 Anti-Mouse CD11c Antibody[N418]

E-AB-F0991L

Elabscience

PE/Cyanine7 Anti-Mouse CD80 Antibody[16-10A1]

E-AB-F0992H

Elabscience

PE Anti-Mouse CD86 Antibody[GL-1]

E-AB-F0994D

Elabscience

APC Anti-Mouse CD40 Antibody[FGK4.5/FGK45]

E-AB-F1028E

Elabscience

PerCP Rat IgG2b,κIsotype Control[LTF-2]

E-AB-F09842F

Elabscience

Elab Fluor® 488 Armenian Hamster IgG Isotype Control[PIP]

E-AB-F09853L

Elabscience

PE/Cyanine7 Armenian Hamster IgG Isotype Control[PIP]

E-AB-F09852H

Elabscience

PE Rat IgG2a,κIsotype Control[2A3]

E-AB-F09832D

Elabscience

APC Rat IgG2a,κIsotype Control[2A3]

E-AB-F09832E

Elabscience

Purified Anti-Mouse CD16/32 Antibody[2.4G2]

E-AB-F0997A

Elabscience

10×ACK Lysis Buffer

E-CK-A105

Elabscience

Cell Staining Buffer

E-CK-A107

Elabscience

RPMI 1640

PM150110

Pricella

L-Alanyl-L-Glutamine Solution

PB180419

Pricella

Penicillin-Streptomycin Solution

PB180120

Pricella

特级胎牛血清

164210

Pricella

XJM003A、XJM003B暂未上线,其他产品可点击货号查看详情。

以上就是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养和鉴定过程,包括细胞的分化、成熟以及流式细胞术的鉴定方法。通过这些步骤,科研人员可以高效地获得高纯度的BMDC,为肿瘤免疫研究和临床应用提供重要的实验基础。希望本文能为您提供实用的指导和参考。更多流式干货,请持续关注流式课堂专栏!


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