小鼠骨髓来源树突状细胞的培养和鉴定

试剂准备和样本准备

BMDC全培养基的配制

在RPMI 1640基础培养基中（PM150114，Pricella^®），加入终浓度为2 mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液、终浓度为100 U/mL的青霉素溶液、终浓度为100 μg/mL的链霉素溶液和终浓度为10%的特优级胎牛血清，配制好后4℃分装保存，1个月内使用完毕。  

BMDC分化培养基的配制

使用BMDC全培养基稀释Mouse DC cell Differentiation MIX(1000X)到1X，即50 mL BMDC全培养基中加入50 μL Mouse DC cell Differentiation MIX(1000X)，轻轻吹打混匀。配制好后4℃保存，2周内使用完毕。

BMDC成熟培养基的配制

使用BMDC全培养基稀释Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X)到1X，即50 mL BMDC全培养基中加入50 μL Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X)，轻轻吹打混匀，即为BMDC成熟培养基。配制好后4℃保存，2周内使用完毕。

1X ACK Lysis Buffer的配制

取出4℃预冷的10X ACK Lysis Buffer（预先使用0.22 μM滤膜过滤除菌）和无菌去离子水，每900 μL无菌去离子水中加入100 μL 10X ACK Lysis Buffer，轻轻吹打混匀。配好的1X ACK Lysis Buffer 4℃预冷保存，24h内使用完毕。

小鼠骨髓细胞单细胞悬液制备

无菌环境制备小鼠骨髓细胞单细胞悬液。

BMDC的分化培养

第0天

使用BMDC分化培养基调整细胞密度到5×10⁵cells/mL后，接种细胞到培养皿中，于 37℃ 5% CO₂培养箱培养。

第1天

每皿细胞补加二分之一体积的BMDC分化培养基，轻轻晃动培养皿混匀，镜下观察细胞状态并拍照。

第3天

收集悬浮及疏松贴壁的细胞，150 g离心3 min，小心弃去上清。使用BMDC分化培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度到5×10⁵cells/mL，接种细胞到新的培养皿中，于 37℃ 5% CO₂ 培养箱继续扩增培养。

第 5天

收集悬浮及疏松贴壁的细胞，细胞计数后，150 g离心3 min，小心弃去上清。使用BMDC分化培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度到5×10⁵cells/mL，接种细胞到新的培养皿中，于 37℃ 5% CO₂ 培养箱继续扩增培养或进行下游实验。

第 5~7 天

细胞培养至第 5~7 天已形成不成熟的DC细胞，可根据实验目的，收集细胞进行计数，进入下游实验或继续诱导成熟。

注：在第5~7天的细胞扩增培养期，细胞增殖很快。若需继续培养，可观察细胞培养密度和状态。若培养基变色明显，细胞聚团较多，可每24 h补充二分之一体积的分化培养基，每48 h全换液，为细胞增殖提供充分的营养和生长环境，延长培养时间有利于增加DC细胞的纯度，DC细胞纯度可达70~80%。

BMDC的成熟培养

收集培养第5~7天的悬浮及疏松贴壁的细胞，细胞计数后，150 g离心3 min，小心弃去上清。使用BMDC成熟培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度到5~8×10⁵cells/mL，接种细胞到新的细胞培养皿中，于 37℃ 5% CO²培养箱继续培养24 h。

收集悬浮细胞及疏松贴壁的细胞（此时为成熟的DC细胞），计数，进行表型鉴定或进入下游实验。

BMDC的鉴定

收集未成熟或成熟的DC细胞，加入流式抗体进行检测。

相关鉴定抗体和试剂