小鼠腹水及单细胞悬液制备及注意事项
Source: Elabscience®Published: 2022-06-07
小鼠腹水及单细胞悬液制备流程
1. 配制6%淀粉肉汤。
6%淀粉肉汤配制方法:牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 1.0 g、氯化钠 0.5 g、蒸馏水 100 mL,上述材料混合加热后加入可溶性淀粉6.0 g;溶解后,121℃高压灭菌15~20 min,EP管分装封口,将肉汤放置于4℃保存。
2. 小鼠腹腔注射1 mL 6%淀粉肉汤(注意避开肠管和内脏),刺激60~72 h。
3. 颈椎脱臼法处死小鼠,用75%酒精浸泡小鼠5 min。
4. 将小鼠置于解剖板中,固定四肢,剪开皮肤,充分暴露腹膜。
5. 用眼科镊子提起腹膜,用5 mL 注射器往小鼠腹腔注射2.5 mL预冷PBS(勿扎到脏器),轻揉小鼠腹部1~2 min。注射器回抽腹腔灌洗液,收集于15 mL离心管中。
6. 重复第5步5次,冲洗腹腔,可观察到冲洗液逐渐澄清。
7. 将收集的腹腔灌洗液300 g离心5 min,弃上清。
8. 用细胞染色缓冲液或者含10%胎牛血清的1640培养液重悬细胞。
9. 进行细胞计数,并调整细胞浓度至1×107/mL。
小鼠腹水FSC/SSC图
注意事项:
1. 若第7步离心弃上清后发现细胞沉淀中有较多红细胞,且检测目的细胞非红细胞,先加入适量红细胞裂解液裂解红细胞(可加入500 μL 1×红细胞裂解液重悬细胞,室温裂解2 min后,立马加入10 mL PBS,300 g离心5 min后弃上清)。
2. 若提取的腹腔巨噬细胞需培养,请注意无菌操作。
3. 收集腹水时,从小鼠左侧(肠道较多)注射PBS,从右侧(器脏较大)抽腹腔灌洗液,注意不要扎到器脏。
4. 小鼠腹腔灌洗液收集细胞比较脆弱,加细胞染色缓冲液有利于细胞的保存,但建议当天及时检测。
5. 小鼠腹腔灌洗液中大多数为巨噬细胞,巨噬细胞检测需要封闭Fc受体,此时可使用小鼠CD16/32纯抗[E-AB-F0997A]进行封闭:往100 μL(细胞数1×106)细胞悬液中加入1 μg纯抗,室温封闭15 min,直接加入流式抗体进行后续实验。
6. 巨噬细胞检测应尽量避免使用含花青素的流式抗体(如PE-Cy7),会增加非特异性染色。若为非巨噬细胞检测,使用含花青素的流式抗体(如PE-Cy7)时也需要封闭。