小鼠外周血单细胞悬液制备流程及注意事项

小鼠外周血单细胞悬液制备

1. 采集小鼠外周血样本于抗凝管中。

2. 离心管内加入100 μL新鲜血，加入1 Test对应流式抗体，混匀，4℃避光孵育30 min。

3. 加入2 mL 1×红细胞裂解液，混匀，4℃裂解5 min。

4. 300 g离心5 min（裂解完立即离心，防止时间过长损伤细胞），弃上清可得到白色的细胞沉淀。

5. PBS洗涤一遍。

6. 加入200 μL细胞染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。

C57小鼠外周血FSS/SSC图

C57小鼠外周血CD45/SSC图

注意事项：

1. 采血用抗凝管，有肝素和EDTA两种，若直接裂解红细胞后进行后续染色实验，两种抗凝管都可使用；如果是采血后进行PBMC细胞分离，则必须使用肝素抗凝。

2. 裂解液推荐使用E-CK-A105 10× ACK Lysis Buffer，不含固定剂。

3. 10× ACK Lysis Buffer实验前需用纯水稀释成1×，现配现用，推荐4℃条件下暂存，当天使用。

4. 检测小鼠外周血中常规指标，可用过夜保存的样本，一般来说问题不大，但是对于表达量比较低的指标，建议用新鲜的样本检测。

5. 小鼠外周血中细胞量比较低，建议用先染色后裂解的方法。这种方法可以减少样本处理过程中洗涤的次数，从而降低细胞的损失，避免有些比例较低的细胞检测不到。