产品常见问题
Elabscience® 整理汇集了抗体&蛋白产品应用过程中最常见问题的解答（FAQs），旨在更高效地为客户提供技术支持。
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我们的抗体是浓缩型的，抗体最终使用浓度除了跟抗体本身浓度有关，也跟样本中目的蛋白的丰度有关，所以我们说明书提供的抗体推荐稀释比是一个范围，最终稀释比例是需要您通过预实验确定的，当然您也可以咨询我们的技术团队给您推荐一个合适的稀释比来摸索实验条件。IHC是免疫组化实验，使用的切片一般包含有IHC-P（石蜡切片）和IHC-F（冰冻切片）两种。首先客户需要根据抗体说明书&预实验结果来预估一下抗体的使用量，不同的样本，因抗原的表达量不同，抗体稀释比会有差异的。 例如：某个抗体的IHC实验，预实验确认按稀释比1：50计算，通常情况下，一张切片需要加入稀释后的抗体100μl，也就是一张切片需要2μl抗体，20μl大概可以做10张切片。抗体说明书中提到的物种是确认可以做的，但不能保证抗体可用于未经验证的物种， 即使序列比对同源性高。抗体是否能识别其它物种样本内的蛋白涉及许多因素，我们无法做出预估。如果没有其它的选择，您必须考虑购买抗体用于未验证的物种，我们建议您将免疫原序列与您的目的蛋白序列进行比对，同源性高的话成功的可能性会比较大。如果您购买的抗体是用于未经验证的物种或者实验应用，一般无法提供产品的更换或者退款。一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证适用于何种实验的类型(如： WB、IHC、IP、IF等)， 如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，可能是我们这边没有做相应的验证，或者验证的样本效果不太好，一般如果没有的应用或者反应性不推荐客户使用，请尽量根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。 如果客户想尝试，可以提前咨询技术支持或者购买小规格进行相应实验尝试，但没有做出预期的结果，一般无法提供产品的更换或者退款。二抗根据一抗的来源和客户的实验需求来选择。 先看实验所用一抗的种属来源和亚型。根据一抗种属来源和亚型来决定二抗：如一抗是兔来源的IgG，那就选抗兔IgG的二抗，例如Goat Anti-Rabbit IgG；如一抗是小鼠来源的IgM，那就选抗小鼠IgM的二抗，例如Goat Anti-Mouse IgM。 标记物的选择。常见的标记物有有HRP、Biotin、荧光素等。 ELISA常用Biotin标记的二抗，后接一个链霉亲和素标记的HRP起到进一步信号放大作用，用TMB底物显色； WB主要选择HRP标记的二抗，用ECL底物发光液显色； IHC一般也是选择HRP标记的二抗，推荐使用免疫组化试剂盒（E-IR-R217或最新的E-IR-R220/221），一般用DAB底物液显色； IF可按实验需要选择不同荧光素标记的二抗，如FITC、Cy3、PE等均可（尽量避开细胞的自发荧光），通过荧光显微镜检测荧光。阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据，也是确定待测标本中是否存在待测蛋白的一个依据！尤其是检测的标本不确定是否有待测蛋白表达时。因此当实验没有阳性结果出现时，最好选择实验合适的阳性对照，大部分说明书上都有推荐的阳性对照；或者根据说明书上的SwissProt 或 Omnigene 数据库查找，这些数据库经常会列出该蛋白在哪些组织里面高表达，这些样本可以作为合适的阳性对照。因为同一蛋白在不同的种类的细胞中可能由于转录后有不同的剪切体、翻译后有不同的修饰方式，比如糖基化、泛素化等，分子量并不是唯一不变的，另外，蛋白官网Uniprot上可以查找到蛋白不同的亚型分子量大小是有差异的。所以文献上查到的分子量与说明书上抗体分子量有些会有一定的差异。（可以多查一些文献参考确认目的蛋白在目标样本中的分子量）。修复条件一般为高温高压或者微波加热修复。 例如：抗原修复（高压法） ：压力锅中加入足以淹没切片的 10 mmol/ml 的枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0） （配制：将抗原修复液溶于相应体积 ddH2O中，混匀），加热至沸腾，切片置耐热塑料切片架上，放入锅中，盖好锅盖，扣上压力阀，继续加热，设置保压 4 min，时间到后打开放气阀放气，压力归零后开锅盖将内锅取出放置室温冷却，待溶液冷却至室温后取出切片（约30 min）。 抗原修复（微波法） ：烧杯中加入足以淹没切片的 10 mmol/ml 的枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0） （配制：将抗原修复液溶于相应体积 ddH2O中，混匀），加热至沸腾，切片置耐热塑料切片架上，放入烧杯中，中小火加热30min后取出，放置室温冷却，待溶液冷却至室温后取出切片（约30 min）。 IHC修复液的选择建议参考抗体使用说明书，或者参考以下方案：人体样本，优先推荐使用pH9.0的EDTA修复液（临床样本）；大/小鼠样本，优先推荐使用pH6.0的枸橼酸修复液（科研样本）。默认按照说明书标注的形式发货；如果有特殊需求，需要根据蛋白情况确定。原则上，冻干粉蛋白可以发液体形式，液体蛋白不能发冻干粉形式。我们的蛋白有液体和冻干粉2种形式，一般来说冻干粉可以用冰袋、蓝冰、干冰运输；液体可以用蓝冰或干冰运输。内毒素含量小于0.1 ng/μg (1 EU/μg)的蛋白都可以用于细胞培养/注射小鼠。我们在售重组蛋白一般不含变性剂，具体见说明书的formulation信息。常见变性剂有：尿素和盐酸胍。活性说明的见说明书bio-activity部分；如果说明书显示没有生物活性或则显示生物活性检测中，则说明这个蛋白没有生物活性数据，需要客户自己检测。一般通过纯化标签进行亲和纯化，常规有镍柱/His Tag、protein AG/Fc tag、标签抗体凝胶等。蛋白的纯化方式一般通过标签进行亲和纯化，无标签的蛋白是在纯化后进行了标签切除。牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38 g/1000 ml），分子量68 kD。等电点4.8。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking buffer。客户那边如果是用来做为ELISA实验的封闭蛋白，能否适用具体要看客户的实验体系，不同的BSA对于ELISA实验封闭来说区别很大，客户可以通过预实验来判断。用TBST稀释，BSA浓度 2-5%。封闭操作时间通常为1.5小时。本试剂盒为经典WB实验提供全套试剂，包括从蛋白质提取到结果检测所需试剂，具有操作简单、检测灵敏度高、背景低、系统稳定性强等优点。由于PVDF膜有两种孔径，分别适用于转不同分子量大小的目的蛋白, 为了满足不同实验需求，我们设计了两种规格 E-IR-R304A（PVDF膜0.45 μm孔径）建议用于检测分子量大于20 kDa的蛋白质 E-IR-R304B（PVDF膜0.22 μm孔径）建议用于检测分子量小于20 kDa的蛋白质。E-IR-R305凝胶试剂盒是不包含在E-IR-R304A和E-IR-R304B里面的，需要单独购买凝胶试剂盒；E-IR-R304A和E-IR-R304B试剂盒有包含滤纸，但不含海绵垫；做WB实验需要的仪器，超声仪，水浴锅，移液枪及枪头，离心机，电泳槽，SDS-PAGE电泳仪，转膜仪，摇床，wb成像系统仪器。这两个都是酶的抑制剂，作用是预防蛋白的降解。 PMSF常作为蛋白酶抑制剂被应用在生化和分子生物学实验中，是丝氨酸蛋白酶的抑制剂，可抑制胰蛋白酶（trypsin），糜蛋白酶（chymotrypsin）和AChE的活性。 Na3VO4是磷酸酶抑制剂，抑制ATP酶、碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶。 试剂盒这两个产品是100X的，使用前按照1:100的比例加入到PIPA裂解液中。RIPA裂解液裂解细胞后，细胞核内的DNA比较完整的弥散到样本里，形成一团黏糊糊的液体，遇到这种情况裂解后可再超声处理，在35~40％的功率下，超声处理样本1 min（冰浴条件下进行），超声2 s，间隔2 s，确保细胞充分裂解，降低样本粘度。大约可裂解1X 10^6个细胞，如果使用孔板操作，建议6孔板中每孔加入100-150 μL RIPA裂解液。不可以, 免疫共沉淀的细胞裂解液是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液，常规的RIPA裂解含有SDS，会对蛋白产生变性作用，对蛋白间的相互作用有影响。做免疫共沉淀推荐使用不含变性剂的裂解液。如果是做磷酸化抗体，是必须加矾酸钠抑制剂，如果是做的普通抗体可以只加PMSF（蛋白酶抑制剂）。悬浮细胞：将细胞悬液转移到预冷的EP管中，4°C，1000×g离心10 min去上清，用2-8°C的PBS（0.01 M，pH 7.4）洗一次，再4°C，1000×g离心10 min去上清，沉淀备用。 贴壁细胞：吸弃培养液，用2-8°C的PBS（0.01 M，pH 7.4）将细胞洗两遍。用细胞刮刮下细胞，或者用EDTA溶液处理使贴壁细胞松动，用移液器吹打下细胞，将细胞悬液转移到预冷的EP管中，4°C，1000×g离心10 min去上清，用2-8°C的PBS（0.01 M，pH 7.4）洗一次，再4°C，1000×g离心10 min去上清，沉淀备用。货号E-BC-R288上样缓冲液是还原型的，还原型的里面有加DTT。 关于蛋白样本是否需要稀释，需要根据BCA检测浓度后确定，如果提取蛋白浓度大于5 mg/mL可适当稀释，使用PBS稀释，使蛋白浓度在4-5 mg/mL左右再制样。如果提取的蛋白浓度低于5 mg/mL 可直接按说明书比例加loading buffer制样。可以-20°C保存一个月，不过蛋白可能还是会有一定的降解，建议使用新鲜样本。ECL可以用于ELISA实验，(ECL) 底物液是一款辣根过氧化物酶 (HRP) 底物，可用于检测辣根过氧化物酶（HRP）标记的蛋白，具体的用量可参考说明书操作。不建议重复使用。-20℃下保存至少一年有效，4℃可存放1~2周左右，不建议于室温存放，可以在-80℃下保存。 为避免产品反复冻融对产品效果带来的负面影响，建议在收货后完全溶解产品后按需分装保存。会对产品的效果产生一定的影响，可通过预实验验证产品是否可用。会对产品的效果产生一定的影响，可通过预实验验证产品是否可用。上样缓冲液会对电泳液产生影响，如果溢出量较少可忽略，如果溢出较多，需要及时更换新鲜电泳液，避免影响后续电泳效果。 同时为避免缓冲液溢出，建议在使用前置于37℃以下温度温浴完全溶解后再使用。不建议进行这样的操作。煮沸后的蛋白不易与缓冲液完全混匀，影响电泳效果，先混匀蛋白与缓冲液再煮沸也利于蛋白的变性。使用时一般先将蛋白与上样缓冲液完全混合均匀后再进行煮沸变性。若于上样缓冲液中发现沉淀，可于室温或37℃下溶解，沉淀完全溶解后可继续使用。溶解时不可长时间处于水浴中或直接煮沸，避免产品中某些组分变质。不会。缓冲液中的SDS可与蛋白质结合并使蛋白质-SDS复合物带上大量负电荷，将蛋白质本身的电荷完全覆盖。可使用稀释至1X的缓冲液对变性后的样本进行稀释。如果蛋白样品中含有比较多的二聚体，可以添加还原剂DTT以帮助打开二聚体。若蛋白条带移动速率不均匀，建议于37℃以下温浴中完全溶解上样缓冲液后再加入蛋白样品，与蛋白样品混合均匀后煮沸10分钟来完全变性蛋白样品。 若蛋白条带移动速度较慢，需及时检查电泳内槽是否漏液。变性后的蛋白缓冲液出现沉淀可能与蛋白样品中的离子浓度有关系，在温度变化过程中出现沉淀，可通过37℃以下的水浴孵育溶解。若仍有少量沉淀无法溶解可离心后取上清使用。100℃。本产品适用于变性电泳的各种电泳缓冲液体系。煮沸是为了蛋白变性，加入缓冲液煮沸后变性的蛋白已经完全变性，无需再进行煮沸，完全溶解后点样即可。本款产品中主要成分为Tris-HCl、溴酚蓝、SDS、DTT、甘油等。延长电泳时间可以使溴酚蓝与条带分开，对于小分子量蛋白建议更换浓度更适合的分离胶缓冲体系。可能由于缓冲液中的甘油没完全混匀，建议缓冲液在室温或不超过37℃下完全溶解后再使用。不能，本产品含有DTT等还原剂，不可用于非变性电泳中。可以使用1×缓冲液直接进行煮沸，但需要注意此操作后得到的蛋白上样缓冲液不可用于BCA测浓度。本产品对蛋白浓度无具体要求，按比例稀释使用即可。上样缓冲液使用前需要充分混匀后再使用，样本和上样缓冲液也需要充分混匀，充分混匀后再煮沸变性可避免此类情况发生。溴酚蓝会随pH值的变化在黄色到蓝紫色之间产生变化，不影响产品正常使用，发生类似变色情况不影响后续电泳情况，可继续进行实验。建议进行对比实验，设置BSA为阳性对照，与蛋白样本裂解液同时加入缓冲液混匀煮沸变性，上样进行电泳观察条带情况。不需要，本产品中含有DTT，作用与巯基乙醇类似，起到还原剂的作用，同时毒性也更低。本产品pH值为室温（25℃左右）下测定。本产品不包含DTT、巯基乙醇等还原剂。本产品在室温下（25℃左右）放置24小时对产品效果无明显影响，可继续使用。但建议收货后立即分装并于-20℃保存，反复冻融次数不超过5次。本产品可以提取线粒体蛋白。本产品使用时，将去除液恢复值室温时即可使用；同一张膜可进行抗体清除1~2次，通常以1次为宜。可以。DAPI可以使用405纳米的激发光进行激发。虽然DAPI最佳的激发波长在紫外光区域（约350-360纳米），但它也能够在405纳米的蓝光下进行有效的激发。使用405纳米的激发光源仍然可以激活DAPI并产生蓝色荧光，用于观察和成像细胞核。本产品仅适用于固定后细胞的染色，不建议直接对活细胞进行染色也不建议使用DAPI染色来判断细胞凋亡情况。若要对细胞进行凋亡情况的判断，建议使用专门的检测试剂盒，如TUNEL、Annexin V-FITC等。本产品在使用时直接按说明书稀释至工作液浓度即可，无需额外调节pH值。不建议回收使用。本产品内含有缓冲盐溶液，由浓缩液稀释成工作液后pH值不会产生较大变化，无需再次调节pH值。蛋白酶K有效pH范围为pH4.0~12.5，最佳pH范围为pH7.5-8.0。请根据实验需求尽量用上述适当pH的缓冲溶液，如：10mM Tris-HCl pH7.4-7.8，进行蛋白酶K溶液的配制。 蛋白酶K常用工作浓度为10~100ug/ml，储存液浓度一般为100~200mg/ml，-20℃保存，稀释至工作浓度后应尽快使用，避免长时间保存。不需要。通常情况下，在4% 多聚甲醛中固定后，肿瘤组织切块可以在室温下保存数周至数月时间。对于长期保存，更好的做法是将固定后的组织样本转移到含有PBS等缓冲液的液体中，并且存放在4摄氏度的冰箱中，确保其稳定性和适用性。多聚甲醛（PFA）是一种常用的组织固定剂，通常用于固定生物样本中的蛋白质和细胞结构。虽然PFA可以帮助保持细胞结构和蛋白质的形态，但由于PFA具有渗透性，可将细胞内外的蛋白质固定在一起，且不同细胞的渗透性也并不一致，故而PFA固定可能会造成对细胞膜的破坏。应根据将用于细胞膜的哪方面研究来选择合适的固定液。细胞膜发生起泡现象可能是由于固定时间过长所致，可以适当缩短固定时间，优化固定结果。多聚甲醛易挥发，注意低温密封避光保存。使用本产品配制TBST时，控制吐温终浓度为0.1%即可。本产品可直接用于染色，无需稀释。若在实验前发现染液出现蓝色沉淀，可使用滤纸进行过滤后再使用。染液是否失效需要根据染色结果进行判断。使用Triton X-100裂解细胞时浓度一般为1%；稀释时可使用PBS或者TBS。本产品中不含叠氮钠，如有需要可自行添加。都可以兼容。可能由于凝胶中的杂质没有除尽造成了脱色困难，可通过在脱色过程中计时更换去离子水、延长脱色时间以及适当提高脱色温度进行改善。本产品可重复使用2~3次。
