产品常见问题
为了提供更好的客户支持，解决客户关于细胞功能检测相关产品的疑问，我们整理并发布了关于细胞功能检测产品最常见问题的解答（FAQs），并将持续更新。
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如果不做阴阳性对照的话，50 Assays可以做5 cm2大小的样本50个样（一个盖玻片或12孔板大小）。需要做阴阳性对照的话，每次实验需用2 Assays用于对照组。Elab Fluor® 488的抗淬灭效果比FITC好，比FITC更适应于在较长时间下的显微镜下观察。DAB显色是用普通显微镜看的，TUNEL结果和核染料只能一起在白光下观察。荧光显微镜TUNEL的荧光和核染料的荧光是通过不同的荧光通道去看的，看的更清晰，分辨的更清楚。第1处是避免光照对TdT酶活的影响，此处用的湿盒就是避光的；第2处避光是：生物素分子很容易被光分解,生物素分子中的双键很容易接受光的激发,分解产生紫外光和活性自由基等物质,这些分解产物会破坏生物素和被标记分子之间的化学结合,进而影响实验结果的准确性和稳定性。需要的。3%H2O2阻断剂：许多组织细胞内存在过氧化物酶活性,从而导致辣根过氧化物酶标记免疫组化染色出现假阳性结果。为此,组织切片在染色前需采用阻断措施，以消除内源性过氧化物酶的活性。3%的过氧化氢可以与过氧化物酶反应，消除内源性过氧化物酶的活性，起到阻断的作用。可以测mouse，TUNEL试剂盒不分种属。可以用于检测精子样本。我司未进行过昆虫样本的TUNEL实验检测，如果客户需要用昆虫样本进行检测，可以查阅资料后进行预实验摸索实验方法。理论上是可以检测的，如果客户要做的话，可以自行摸索样本制备方法。TUNEL试剂盒是检测DNA的片段化，红细胞无细胞核，也无线粒体等细胞器，因此不能检测红细胞的凋亡。（1）不用爬片的话没法封片保存。
（2）不用爬片，用六孔板的话，试剂的用量会增加。
（3）由于孔较小，物镜的观察视野比较小。理论上该试剂盒是可以和免疫荧光共染的，但是我司没有相关的实验验证，无法保证实验效果，建议您做一个预实验摸索一下实验条件。有几个需要注意的地方您可以留意一下：1. 针对切片样本，使用的通透剂是蛋白酶K，可能会对免疫荧光的抗原有影响；2. 石蜡切片做免疫荧光需要做高温或高压的抗原修复，这个过程可能导致DNA断裂，造成TUNEL结果假阳性。可以，客户可以将细胞收集到EP管中，按实验步骤进行后续操作，最后用流式细胞仪上机检测，或是吸取细胞悬液到载玻片上用显微镜观察。不需要，抗原修复后会导致核酸断裂，出现阳性信号。冰冻切片千万不要烘干，切完放在-20或者-80保存，一周内使用-20保存可以，长期不用放在-80保存。实验前取出室温复温20分钟左右，在切片上滴加4%的多聚甲醛甲醛，室温固定30-60分钟后，再洗涤，按照说明书操作。TUNEL试剂盒中的平衡液是为了给TdT酶提供最佳反应条件。建议用超纯水稀释，不能用DEPC水稀释，DEPC水是用来保护RNA或者DNA不被酶解的，用它来稀释DNA酶，DNA酶就失效了，提取RNA的时候可以用这个DEPC水来溶解RNA。可以浸泡在PBS中于4℃过夜。如果已经固定过，则不需要再次孵育固定，可以直接进行后续实验步骤。不能用中性树胶，因为切片染色完毕后，是处于水溶性状态，要用水溶性的封片剂，中性树胶是非水溶性封片剂，封片了之后会糊成一团，片子被破坏，用抗荧光淬灭封片剂来封片即可。可以，如果用含DAPI的封片剂，就不需要用试剂盒中包含的DAPI染料，并且由于DAPI孵育后没有清洗，会造成较高的背景荧光。不能。TUNEL的原理是将荧光标记的dUTP连接到断裂DNA的3'-OH末端上，已经做过一次TUNEL实验的切片样本，其3'-OH末端可能已经被占用了。具有高增殖或代谢活性细胞群，可能会存在DNA链的断裂，在这两种情况下，假阳性结果可能是样本本身带来的。当客户对结果的解释存疑时，细胞形态学的评价是一个重要的参数。组织透明，玻片不挂水即为脱蜡干净。A视野荧光总强度除以A视野内细胞的总面积就是平均荧光强度。DAPI染色的是总DNA，TUNEL染色的是凋亡的断裂的DNA，所以DAPI染色代表的总面积，TUNEL染色代表的凋亡的DNA，总荧光亮度除以总DNA的面积，最终就得出了平均染色比率。最主要的检测方式不同，一个用荧光显微镜检测，一个用流式细胞仪检测，其次检测样本也有所不同，原位主要检测的是石蜡切片，冰冻切片，细胞爬片或涂片。流式主要检测是细胞样本，包括悬浮细胞与贴壁细胞。答：E-CK-A211里面的缓冲液是10×的，需要稀释了以后再做实验，盒子保质期是一年。
E-CK-A211B里面的缓冲液是1×的，可以直接使用，不用稀释，因为是稀释液，所以盒子保质期是6个月。不建议检测血液样本，血液中血小板及很多免疫细胞自身存在PS外翻的情况，会影响检测结果。Annexin V试剂盒可以用于贴壁细胞，但是需要注意以下几点：
1. 贴壁细胞诱导细胞凋亡时出现的漂浮细胞也是需要收集起来的，与后续收集的贴壁细胞一起检测。
2. 消化贴壁细胞要操作轻柔，避免人为操作带来的细胞损伤。
3. 胰酶消化的时间要适宜。尽量不使用含EDTA的胰酶，因为EDTA会影响Annexin V与PS的结合。如果一定要用含EDTA的胰酶，终止消化后要将细胞洗涤干净，尽量去除EDTA。如果流式细胞仪有DAPI通道，可以选择E-CK-A258 Annexin V-APC/DAPI Apoptosis Detection Kit；如果没有，则选择E-CK-A218 Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Detection Kit。我司没有进行过植物样本的验证，如果您有需的话，可以做预实验看下效果。不建议使用Annexin V试剂盒直接检测冻存细胞，冻存操作可能会导致细胞凋亡坏死，得到不准确的实验结果。答：最优用这个，干扰较小：Annexin V- Elab Fluor® Red 780/DAPI Apoptosis Kit E-CK-A280。
客户如果没有DAPI通道，那就用：Annexin V- Elab Fluor® Red 780/7-AAD Apoptosis Kit E-CK-A240。
Elab Fluor® Red 780检测通道同APC-CY7，如果客户没有DAPI通道也没有APC-CY7通道，那就只能用：Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Kit E-CK-A216，这个的干扰较大。答：Annexin V-APC/DAPI Apoptosis Kit E-CK-A258，这款可以满足细胞要求，但需确认流式细胞仪有405nm激光器。不可以，因为Annexin V与磷脂酰丝氨酸（PS）的结合依赖Ca2+，而常见的PBS溶液中不含Ca2+，而Binding Buffer 含有Ca2+，可以促进Annexin V与PS的结合。不加Binding Buffer，会导致Annexin V的结合能力降低，造成阳性信号大幅下降甚至无阳性信号。正常我们做Annexin V一般是做细胞系样本，圈门就只圈除碎片的以外的有效细胞，组织样本中由于细胞种类会多一些，具体看老师想检测整个组织样本的凋亡还是只检测其中某种细胞的凋亡，只检测某种细胞的凋亡有时还需要跟一些特异性的流式指标染色，先圈出细胞群再去看凋亡，有一些细胞群也能在FSC/SSC中直接圈出，不过群的位置也需要反圈门去确定。还有一点就是组织样本的处理也比较关键。处理不好可能会导致由于样本处理而导致的假阳性。固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败、和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能精准定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。absolute ethanol是无水乙醇，不建议用70%的，因为第三步需要保证乙醇的比例。
如果有的sub-G1峰话，是可以检测到的。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及 DNA 片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组 DNA 片段在染色过程中丢失，因此凋亡细胞在 PI 染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于 1，在流式检测的结果图上出现所谓的 sub-G1 峰，即凋亡细胞峰。周期检测是要用到无血清培养基的。实验开始前，需要用无血清培养基培养12h，使周期同步化（注意细胞状态，无血清培养时间不能太长；细胞状态太差的话，细胞可能就不增殖了，G2期会比较少，还可能会出现亚G1凋亡峰）。然后换用正常培养基开始药物处理、干预等实验，最后收样进行细胞周期的检测。流式细胞仪检测：125个样（1~5×10^5 个细胞）
荧光显微镜检测：100个样（96孔板）、50个样（24孔板）Calcein AM只有进入细胞内被细胞中内源性酯酶水解后才会有强荧光，未进入细胞的Calcein AM几乎没有荧光，所以上机前不需要洗。不建议把染料稀释后再分装，这样会导致Calcein AM水解，Calcein AM建议原液保存更稳定。Calcein AM原液可以根据需要进行分装，-80保存有效期更长，经常使用可以放在-20。使用buffer稀释后最好一天内用完，现配现用。细胞量最少需要100万个，蛋白浓度在1-4 mg/mL之间都可以。sf9细胞是昆虫细胞，如果caspase确实参与了昆虫细胞的凋亡途径的话，是可以用的。Caspase9试剂盒检测的是caspase9的酶活性，也就是被激活的caspase9，具有活性的caspase9是cleaved caspase9的二聚体或者四聚体。JC-1是需要同时检测FL1和FL2通道的变化来确定线粒体膜电位的变化的，与GFP存在荧光干扰，因此细胞带GFP的话是不能适用此款试剂盒的。JC-1 有单体和多聚体两种存在形式，两者发射光谱不同。在正常细胞内，线粒体膜电位较高，JC-1 聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可产生红色荧光；凋亡早期，线粒体膜电位降低，JC-1 不能聚集在线粒体基质中，此时 JC-1 为单体，可产生绿色荧光。因此，红色荧光和绿色荧光都是需要观察的。JC-1检测试剂盒不建议用于组织样本，因为组织样本在制备成细胞悬液的过程中，可能会由于机械操作导致细胞凋亡或损伤，这种情况下JC-1的结果可能不准确。另外，此试剂盒只能检测活的单细胞悬液，不能用于切片样本。MTT检测试剂盒广泛用于检测细胞增殖和细胞毒性，而MTS, XXT, WST-1, WST-8都是MTT的升级替代产品，和MTT相比有明显优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原成生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶剂来溶解。WST-8和XTT，MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT，MTS产生的formazan更易溶解。最后，WST-8比MTT，XTT更稳定，线性范围更宽，灵敏度更高。可以在药物孵育结束后，加入CCK-8之前更换培养基，以此来消除药物颜色的影响。IC50指的是半抑制率，可以用CCK8检测，凋亡实验检测的是凋亡率，这个不等同于IC50。这两个实验的实验目的是不一样的。BrdU法步骤繁多，且需要使用BrdU抗体，影响因素较多，稳定性较差。EdU法基于EdU掺入和后续的点击反应，无需使用抗体、操作便捷、检测灵敏度高，是一种在BrdU法基础上升级换代的新方法，将会逐步取代BrdU法。EdU(5-ethynyl-2-deoxyuridine)，中文名5-乙炔基-2-脱氧尿苷，是胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，EdU可以在DNA合成过程中替代胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针（如FITC Azide、Elab Fluor® 488 Azide、Elab Fluor® 594 Azide、Elab Fluor® 647 Azide），通过一价铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应（Click reaction）。不能。Elab Fluor® 594-11-dUTP只是单一组分，而Labeling Solution是包含了标记dUTP的多组分混合试剂。所以建议客户直接购买TUNEL试剂盒进行实验。①实验样本不含荧光，所有的TUNEL试剂盒都可以使用。②如果实验样品带红光，推荐选用One-step TUNEL Assay Kit (Green, FITC) 货号：E-CK-A320或者One-step TUNEL Assay Kit (Green, Elab Fluor®488) 货号：E-CK-A320。
一般来说，Elab Fluor®488的抗淬灭效果优于FITC，如果需要长时间观察样本的绿色荧光推荐使用One-step TUNEL Assay Kit (Green, Elab Fluor®488)。
③如果实验样本带绿光，推荐选用One-step TUNEL Assay Kit (Red, Elab Fluor®594) 货号：E-CK-A322或者One-step TUNEL Assay Kit (Red, Elab Fluor®555) 货号：E-CK-A325。Elab Fluor®594与GFP的干扰更小，如果样本所带绿色荧光较强，优先推荐选择One-step TUNEL Assay Kit (Red, Elab Fluor®594) 货号：E-CK-A322。
④如果实验样品中同时有红色荧光和绿色荧光，推荐选用One-step TUNEL Assay Kit (Red, Elab Fluor®647) 货号：E-CK-A324，但是Elab Fluor®647对荧光显微镜要求比较高，需要显微镜配置有Cy5或Elab Fluor®647滤光片，一般共聚焦显微镜配置有该滤光片。每孔建议孵育500μL的标记工作液。阴性对照组需要进行样本标记步骤。但需要注意的是，阴性对照组标记工作液的配置试剂和其他两组不同。DAPI染色时要求DAPI工作液覆盖样本即可。可以洗涤后浸泡在PBS中，放在4℃冰箱保存。可以的，这个-80冻存的样本可以制作成冰冻切片，然后用冰冻切片做tunel检测即可。一般冰冻切片的厚度是在8-10 µm，太厚了可能会做不出来。如果切片较厚，通透时可根据实际情况适当延长蛋白酶K孵育时间。制作石蜡切片的过程需要烤片，但是切片制作完毕之后做tunel染色的过程不需要烤片。PBS洗涤时加入的PBS一定要完全覆盖住样本，并且保证在孵育过程中不干片。建议室温孵育，25℃左右。Annexin V实验的染色过程实际上是使AnnexinV蛋白与细胞膜上的磷脂酰丝氨酸特异结合的过程，这个过程在细胞功能和酶活性正常的状态下进行为宜。根据试剂盒的规格以及使用方法可以确定具体能测多少样本。说明书中抗体的使用方法有两种，分别是一步法和两步法。一步法抗体使用量为5μL，两步法抗体使用量为2.5μL，我们这边是按照一步法（最大用量）来提供的，也就是说：如果您用两步法来做，规格为20 Assays的试剂盒，可以做40个样本，以此类推。确认下客户的仪器是否有DAPI通道，优先推荐Annexin V-APC/DAPI Apoptosis Kit，货号为E-CK-A258。不能，binding buffer里的钙离子浓度是经过实验摸索后确定的，含钙离子的PBS不一定会有binding buffer的作用和效果。不建议老师使用组织样本做Annexin V实验。一方面，组织样本制备成单细胞悬液的操作过程中，实验操作导致的凋亡可能比样本本身的凋亡率高，而且实验操作具有不稳定性，最终的实验无法判断出样本本身的实际凋亡率。另一方面，组织样本存在多种细胞类型，每种细胞的自发荧光不同，结果无法分析。FITC是490nm/530nm，7AAD是546nm⁄647nm（可以用488nm激发）。一般用FITC通道和PerCP通道就可以检测。上机之前，用未转染的有明显凋亡的细胞分别染7-AAD和APC，作为单阳对照1和单阳对照2；用转染绿色荧光的样本直接上机，作为单阳对照3。对照组细胞可通过以下两种方法诱导凋亡：①由于不同细胞受DMSO的影响程度不同，所以建议通过预实验摸索DMSO的作用时间或体积分数，可以先按以下体积分数（10%）摸索作用时间，每30min镜检一次。②未转染的细胞在50~60℃的水浴锅中水浴5~10min。当细胞形态变化或大量漂浮，可认为产生凋亡细胞群。因为在培养过程中，凋亡的细胞贴壁不牢，会大量漂浮在培养液中。为了结果的准确性，通常建议客户在检测凋亡时将悬浮的细胞与胰酶消化后的细胞都收集起来一起检测。我们没有验证过。因为单细胞硅藻有细胞壁，建议客户做预实验摸索一下染色时间和条件。PBS重悬细胞后逐滴加入-20°C预冷的无水乙醇，边加边震荡，使细胞分散成单细胞。固定时间要求不少于1h。理论上来说，固定后置于-20℃冰箱放置两到三天，对结果影响不大。如果老师的样本不含荧光，红绿蓝荧光的细胞周期试剂盒都可以使用，红色荧光试剂盒（E-CK-A351）更常用。如果样本带绿色荧光，选用细胞周期蓝色荧光试剂盒（E-CK-A353），无需调节补偿。如果样本带红色荧光，推荐选用细胞周期蓝色荧光试剂盒（E-CK-A353）和细胞周期绿色荧光试剂盒 （E-CK-A352）；如果样本带红色和绿色荧光，推荐选用细胞周期蓝色荧光试剂盒（E-CK-A353）。选择E-CK-A353前应先确认流式细胞仪是否有DAPI通道。使用的荧光染料不一样，所以对流式细胞仪的检测通道要求和适用的样本不同。红色荧光的检测通道是PI,PerCP,PE，绿色荧光的检测通道是FITC，蓝色荧光的检测通道是DAPI。银离子，铜离子等重金属离子、卤素离子以及具有氧化性的有机化合物 （硝基化合物、重氮化合物、 羰基化合物和羟基化合物）都会使荧光探针的荧光淬灭，从而影响实验结果的准确性。100 assays是按照96孔板，每孔100ul工作液来算的，24孔板每孔加200ul工作液，大概可以做50个孔左右。基质胶要去除，不去除可能会干扰钙黄绿素与细胞结合；但是我们的钙黄绿素试剂盒没有做过类器官的验证，不清楚最终效果是怎样的，建议先做预实验看一下实际效果。理论上是可行的，但我们没验证过，建议您做预实验摸索一下实验细节。双阳的细胞是状态较差的活细胞，因为细胞膜的通透性增加导致核染料进入到细胞内。双阴的细胞是大颗粒的细胞碎片。蛋白浓度在1~4mg/mL区间范围内，Caspase活性的范围为2~430 U/ng prot。组织样本用干冰冻了之后，基本上细胞形态可能已经被破坏了，无法使用流式检测。可以看看相关研究的ELISA或者代谢的指标，比如凋亡的Bax，Caspase或者氧化应激的SOD，MDA等。①显微镜参数一致；②溶解buffer，观察有无红色小颗粒，如果buffer不溶解，可通过12000rpm离心，取上清。③凋亡细胞贴壁能力较弱，会漂浮在培养基中，如果使用荧光显微镜检测，结果相对不准确，建议优先使用流式细胞仪检测；④收集细胞前，拍100x白光照片（小细胞拍200x，比如淋巴细胞）查看形态学变化。我们不建议用组织样本制备单细胞悬液去做JC-1，制备单细胞悬液的操作对细胞的影响较大，会直接影响JC-1的实验结果。理论上是可行的，但是我们也没有验证过。JC-1的用量以及提取的线粒体的用量我们这边确定不了，可能需要摸索优化。在正常细胞和凋亡细胞中，都有JC-1的单体和聚合物存在。细胞逐渐凋亡的过程中，JC-1慢慢由聚合物解离变成单体，聚合物和单体的比例发生了变化。所以画门的时候普遍聚集在第三象限，画门区分正常细胞和凋亡细胞的时候需要在第三象限划分。一般CCK-8的吸光度值建议在1左右，最好是0.8~1.2。建议用透光的平底，且独立柱状相对最适合。可以。因为流式实验中单细胞比较敏感和脆弱，所以破膜要温和。客户如果没有saponin，可以在PBS中加1%BSA或者3~5%的FBS，然后再加入终浓度为0.2%的triton X-100，混匀后作为破膜试剂。加入BSA可以提高PBS的渗透压和离子浓度，使其更接近于细胞内液的环境，从而减少细胞受到剪切力的影响。此外，BSA还具有一定的缓冲性能，有助于维持PBS的稳定性，防止溶液的pH值发生变化，进一步保护细胞。皂素的通透是可逆的，一般用皂素通透的实验，后面的清洗都会继续加入皂素以维持细胞通透性。理论上是可以做，但是我们没有用过，建议您确定下这个仪器能不能扫描其吸收光谱(230 nm~800nm)，记录A280及A655的数据（1 cm 光程）。150000是抗体的分子量，不同亚型抗体的分子量不同。1道尔顿=1g/mol , 摩尔消光系数 的单位为（L/mol•cm）。如果客户需要用这个公式来计算蛋白浓度的话，还需要知道自己蛋白的 一些固定参数。荧光共定位是利用荧光探针和共定位标记将蛋白质与目标位置连接在一起，我们的标记试剂盒可以让荧光素与蛋白质结合，以使蛋白质的位置可视化。结合的位点是蛋白的伯氨基进行标记，但能否做荧光共定位与蛋白本身有关，或需要通过相关预实验确定。标记试剂盒可以有效地对含有伯氨基（-NH2）分子进行蛋白标记，但是无法确定标记后蛋白的实验应用方向，建议客户做预实验验证实验的可行性。①稀释后的脱蜡液需复温60℃，低温影响脱蜡效果；②建议石蜡切片的厚度为3~5μm，厚度增加可适当延长脱蜡时间；③现配现用；④切片需完全浸入脱蜡液；⑤不同来源的石蜡熔点不同（一般在 56~64℃），此脱蜡液不适用于高于 60℃熔点的石蜡切片。一步法操作更简单，两步法由于减小了孵育体系，所以染料用量减半，更节省试剂，从结果上来看，一步法与两步法的结果分辨率一致。样本带绿色荧光不太适合用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位，因为GFP荧光对FITC和PE通道都有干扰，建议用与GFP没有荧光溢漏的线粒体探针进行检测。我们的产品暂时没有在荧光酶标仪上验证过，结果分析方法待开发。不能，染色完后尽量1h内检测上机，若细胞染色完固定，细胞膜的通透性会改变，会影响线粒体膜电位，导致结果不准确。您好，JC-1主要是检测线粒体膜电位变化的，但线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性时间，发生在细胞核凋亡特征出现之前，所以这说明了您细胞正处于凋亡发生早期而还未进入凋亡晚期。平衡的目的是为了提前让切片/爬片处于TUNEL染色的最佳条件，让TUNEL染色更加充分彻底。CCK-8试剂盒的OD值在0.2~2.5之间具有良好的线性关系可以的，对于流式来说；1% Saponin的通透效果会温和一点；Triton X-100的通透效果会剧烈一点，可能影响结果，不同的样本可能有差异。
建议用0.2%Triton X-100加上3%BSA（PBS配制）来通透细胞，然后离心力一定要注意升速和降速，升速不要超过3，降速不要超过2。这样细胞状态好些，得率高些。1-3% BSA都可以；太低了不行 发挥不了保护载体的作用。Calcein AM/PI活死双染试剂盒主要是活细胞染色，染色后1~2h内抓紧时间上机检测，时间太久细胞状态会变差。如果需要长期培养，在使用buffer染色后，避光在二氧化碳培养箱培养，最好在48h内检测。Calcein AM/PI比较稳定，荧光强度在上机检测的2小时内都没有降低的趋势。荧光显微镜拍照时，建议光强降低，增加曝光时间，拍完后马上关上荧光开关再换位置，染料会更稳定。因为光强太强，染料容易光漂白，就淬灭的快些。在调整曝光强度的过程中，可以先将光照强度调到最低，从最低的曝光时间开始观察，逐渐增加曝光时间和荧光亮度，在荧光拍摄过程中注意调整光照强度和曝光时间，曝光过度，染料容易光漂白，造成过曝，合适的曝光条件为阴性对照无背景荧光，阳性对照不过曝，不同组的同一种荧光素的曝光条件需要保持一致，但不同荧光素的曝光条件可以不同。可以做细胞爬片、细胞涂片，也可以直接在孔板里直接检测，但是需要注意的是，因为孔板的底部可能会存在中间略高四周低的情况，所以加进去的试剂一定要完全覆盖住样本，并且保证在孵育过程中不干片，必要的时候可能需要用到高于说明书写的试剂用量。用孔板直接染色，最后观察需要用倒置显微镜观察，另外还需要注意的是不做爬片的话无法封片保存，需马上观察。1T当做2T用可以，按照说明书两步法操作，但细胞量不要超过5 x10^5个细胞。3%BSA的作用是在缓冲液给细胞提供载体支撑，减少细胞在离心、洗涤等过程中的机械损伤以及降低细胞损失。悬浮细胞需要用到，如果是贴壁细胞在孔板中检测可以用PBS替代。可以的，可以使用2~4%甲醛溶液室温固定30~60分钟，然后洗涤了之后PBS浸泡放在4度冰箱，3天内检测。
