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生化检测常见样本收集及处理方法

一、血液样本的收集和处理

1. 全血

取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中,轻轻颠倒混匀,充分抗凝,得到全血样本,置于冰上待测。

2. 血清

取新鲜血液,室温条件下静置30 min,待血液凝结,2000×g离心10 min,取上层淡黄色澄清液体即为血清,置于冰上待测

3. 血浆

取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中,颠倒混匀,充分抗凝,1000-2000×g离心10 min,取上层淡黄色透明液体即为血浆,置于冰上待测。

注意事项:

①抗凝剂的选择:根据不同抗凝剂的性能特征,选择合适的抗凝剂。实验室常用的抗凝剂有肝素的各种盐、EDTA及枸橼酸钠。生化实验一般建议用肝素抗凝。

②样本保存:全血样本收集好后,若不能当天检测,4℃可保存1-2天。血清、血浆收集好后,若暂时不测定,可分装冻存备用,避免反复冻融,一般4℃可保存一周,-20℃可保存半个月,-80℃可保存一个月。特殊指标对样本有较高要求除外。

二、组织样本的收集和处理

1. 10%动物组织匀浆

取0.02-0.2 g新鲜动物组织块,用2-8°C的PBS(0.01 M,pH 7.4)漂洗,去除血液,滤纸拭干,称重,放入匀浆容器中,按照动物组织重量(g):匀浆介质体积(mL)=1:9的比例加入匀浆介质,低温匀浆。4°C,10000×g离心10 min,取上清置于冰上待测。

2. 10%植物组织匀浆

取0.02-0.5 g新鲜植物组织块,用2-8°C的生理盐水漂洗,滤纸拭干,称重,放入匀浆容器中,按照植物组织重量(g):匀浆介质体积(mL)=1:9的比例加入匀浆介质,低温匀浆。4℃,10000×g离心15 min,取上清置于冰上待测。

注意事项:

匀浆介质:一般采用PBS(0.01 M,pH 7.4)或生理盐水(0.9% NaCl)

匀浆方式:手动匀浆、机械匀浆

手动匀浆:将样本(含匀浆介质)倒入玻璃匀浆管中,匀浆管下端插入盛有冰水混合物的容器中,将捣杆垂直插入匀浆管,上下转动研磨数十次(6~8分钟),使组织匀浆化。
机械匀浆:将已称重的组织装入EP管,加入匀浆介质,用组织匀浆机,在低温条件下,60 Hz,90 s研磨制成组织匀浆。(皮肤、肌肉组织及植物组织等可适当延长匀浆时间)。

注:组织匀浆后,取少量组织匀浆作涂片,显微镜下观察细胞是否破碎,若没有,可适当延长匀浆时间。生化实验一般不推荐用裂解液进行裂解。

样本保存:组织样本若暂时不测定,可低温冻存,避免反复冻融。一般-20℃可保存半个月,-80℃可保存一个月。特殊指标对样本有较高要求除外。制备好的组织匀浆建议不要冻存,最好当天进行测定。

三、细胞样本的收集和处理

1. 悬浮细胞

悬浮细胞可以直接离心来收集细胞沉淀,具体操作:4°C,1000×g离心10 min,弃上清留细胞沉淀。按照106个细胞加入300-500 μL匀浆介质,进行机械匀浆,充分破碎(无明显的细胞沉淀,可在显微镜下观察)。4°C,10000×g离心10 min,取上清置于冰上待测。

2. 贴壁细胞

吸弃培养液,用PBS(0.01 M,pH 7.4)将细胞洗一遍,然后收集细胞(贴壁细胞的收集方式常见的有2种:胰蛋白酶处理和细胞刮收集细胞,生化实验一般建议用细胞刮收集贴壁细胞),加入2-5 mL PBS(0.01 M,pH 7.4),制成细胞悬液,之后处理方法见悬浮细胞。

注意事项:

匀浆介质:一般采用PBS(0.01 M,pH 7.4)或生理盐水(0.9% NaCl)

匀浆方式:手动匀浆、机械匀浆、超声破碎、反复冻融

手动匀浆:将样本(含匀浆介质)倒入玻璃匀浆管中,匀浆管下端插入盛有冰水混合物的容器中,将捣杆垂直插入匀浆管,上下转动研磨数十次(6~8分钟),使细胞破碎。

机械匀浆:将样本(含匀浆介质)装入EP管,用机械匀浆机,在低温条件下,60 Hz,90 s研磨,使细胞破碎。

超声破碎:用超声波发生器以振幅14 μm超声处理30 s,使细胞破碎;或者用超声细胞破碎仪,300 W,3~5 s/次,间隙30 s,重复4~5次。

反复冻融:用PBS溶液或双蒸水重悬细胞,再将细胞悬液进行“冷冻-融化-冷冻”循环,重复3次左右。此法会使某些酶活力受影响,因此检测细胞样本的酶活力时不推荐使用反复冻融来破碎细胞。

注:细胞破碎好以后取出部分匀浆液显微镜观察,如细胞还未破碎则延长匀浆时间。生化实验一般不推荐用裂解液进行样本处理。

四、细胞培养基的收集和处理

直接取细胞上清进行检测,如有浑浊,4°C,3000×g离心10 min,取上清置于冰上待测。

五、体液样本的收集和处理

1. 唾液样本

用清水漱口,30 min后用唾液采集器收集唾液,4℃,10000×g离心15 min,取上清置于冰上待测。

2. 尿液样本

收集新鲜尿液,4℃,10000×g离心15 min,取上清置于冰上待测。

3. 胸水样本

收集新鲜胸水加入含有抗凝剂的试管中,颠倒混匀,4℃,10000×g离心10 min,取上清置于冰上待测。

4. 乳汁样本

取新鲜乳汁,4℃,10000×g离心10 min,弃去白色上层,取中层清液置于冰上待测。

注意事项:

样本保存:体液样本收集好后,若暂时不测定,可分装冻存备用,避免反复冻融。一般4℃可保存一周,-20℃可保存半个月,-80℃可保存一个月。特殊指标对样本有较高要求除外。

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