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流式配色基本原则

Source: Elabscience®Published: 2022-03-14

                                                                                流式细胞实验操作其实是非常简单的一个实验:

样本制成单细胞悬液+抗体加进去染色

实验就做完了

对于大多数新手来说

流式细胞实验前的指标选择和配色才是大家关注的重点

很多人通过文献知道自己要做什么指标

但不理解文献里面为什么要这样配色

是基于什么原因来做配色方案的?

下面,我们为大家带来“流式配色基本原则”

流式配色

流式配色遵循以下基本规则:

强弱搭配

选择干扰少的荧光组合

使分析的复杂程度降到最低

谨慎使用串联染料

注意环境因素对荧光素的影响

我们要如何理解这段话呢?

强弱搭配指的是目标Marker表达量和荧光素的强度要做到强弱搭配,如果出现强强搭配时,强荧光对弱荧光有干扰的话,那么弱弱组合就像大象身边的狗尾巴草,或者白天的萤火虫,会被完全忽视掉。

强弱搭配


不同于WB、IHC、IF或者ELISA检测等单指标检测方法,流式细胞实验一般是多指标检测,仪器检测荧光素的时候,可能会被其他荧光素发出的光干扰。高中物理老师说过:“光具有波粒二象性”。

光的波粒二象性


手机/相机拍照时,只需要“咔嚓”一下,就可以把五颜六色收集到一起;而流式细胞仪以光波的形式,分段接收、检测荧光。

我们可以回想一下:听收音机的时候,如果有电话打进来,收音机会受到电话信号的无线电干扰,发出“呲呲”的声音。同样地,流式细胞仪在检测某个颜色的光波时,可能会受到相邻颜色荧光信号的干扰,所以,在做流式配色时,我们要“选择干扰少的荧光组合”。

无线电干扰


受制于流式细胞仪的配置,出现荧光干扰在所难免。如何将这种影响降到最低呢?

首先,实验需要设置单阳对照,用于调节补偿。在做数据分析时,为了将这种荧光干扰降到最低,可以考虑将有溢漏的荧光素,放在相互排斥的Marker上。

其次如果是共表达的Marker,在表达量高的情况下,是允许溢漏的。

最后,配色时需要考虑Marker的亲子代关系,子代可以向亲代溢漏,亲代不可以向子代溢漏。这么做是为了“使分析的复杂程度降到最低”。

如果目标Marker较少,比如三色、四色等,应尽量选择单体染料(例如:FITC、PE、APC等)。如果检测Marker较多,或者流式细胞仪激光器受限,串联染料(PE/Cyanine5、PerCP/Cyanine5.5等)的使用,是非常有必要的。

大部分串联染料,在光照或者实验操作有“固定”步骤时,容易出现降解。所以,在实验过程中,要避免对串联染料进行固定,同时,要严格按照实验标准化流程操作,避免荧光素降解引起的实验问题。

除了刚才提到的光照和“固定”,容易对串联荧光素造成影响外,串联染料的长期孵育,也会对结果造成影响。因此,细胞染色后,请尽快安排上机检测,特别是在串联染料不便固定时。另外,FITC对低pH环境敏感,如果您的样本pH值较低,一定要注意避免使用FITC染料。

关于流式配色的基本原则,就是上面提到的这些。当然,在实际配色过程中,可能还会遇到诸多问题,您可以点击在线咨询​,由我们的专业技术人员为您提供解答!



细胞内因子染色步骤

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