elabscienceelabscience

全部分类

  • 全部分类
  • 流式细胞术抗体与试剂
  • 细胞功能与代谢测定
  • 免疫测定试剂盒与试剂
  • 抗体
  • 蛋白
请输入货号/产品关键词 !
插入特殊字符:
  • α
  • β
  • γ
  • δ
  • ε
  • ζ
  • η
  • θ
  • κ
  • μ
  • ω
  • σ
  • τ
  • λ
  • ⅩⅢ
  • ⅩⅢ
  • ⅩⅣ
  • ⅩⅤ
  • ⅩⅦ
  • ⅩⅧ
  • 收起 ↑
热门搜索: 最新活动 文献引用 新品速递 一步法ELISA 流式抗体 铜死亡 Annexin V凋亡检测 TUNEL凋亡检测 未包被ELISA 铁死亡 双硫死亡

细胞内因子染色步骤

Source: Elabscience®Published: 2018-08-01

 

一、样本准备

详见流式细胞术样本制备技术

1. 收集细胞,200目筛网过滤,收集滤液,300×g离心5 min,弃上清。

2. 向细胞中加入适量Cell Staining Buffer [E-CK-A107],用移液枪轻轻吹打细胞重悬。

二、细胞计数

用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后,调整细胞浓度约为1 × 107/mL。

三、设置实验分组

根据实验设计,设置实验分组,每管加入100 μL细胞悬液。

实验分组

作用

阴性/空白对照

调节仪器电压

单染/单阳对照

调节补偿

同型对照

消除背景染色

FMO对照

确定设门的准确性

生物学对照

实验结果对比

实验组

实验结果

四、封闭Fc受体

封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

对于小鼠样本,纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合,封闭非特异性染色,使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5~1 μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体(E-AB-F0997A),室温孵育10min。

对于大鼠样本,可使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断,或者用商业化的Fc受体阻断剂。

对于人样本,纯化的CD16单抗可作为封闭FCR封闭剂。加1 μg纯的抗人CD16单克隆抗体(E-AB-F1236A),室温孵育10 min

五、细胞表面抗体孵育

根据实验设计,除空白对照外,对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL,混匀,4℃避光孵育30 min。

六、固定破膜(如果做核内因子的检测,请参照核内因子染色流程

1. 按照说明书稀释固定破膜液(推荐使用Elascience®胞内因子固定破膜剂E-CK-A109)。

2. 每管加入2 mL Cell Staining Buffer [E-CK-A107],300×g离心5 min,弃上清。

3. 加入200 μL Cell Staining Buffer [E-CK-A107],重悬细胞。

4. 每管加入200 μL Fixation Buffer,轻柔混匀,室温避光孵育30~60 min。

5. 加入 1 mL 1×Permeabilization Working Solution,600×g离心5min,弃上清。

七、胞内抗体孵育

1. 加入100 μL 的1×Permeabilization Working Solution,重悬细胞。

2. 对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL,混匀。

3. 室温避光孵育30 min。

4. 每管加入2 mL Cell Staining Buffer [E-CK-A107]

5. 600×g离心5 min,弃上清。

八、上机检测

1. 加入200 μL Cell Staining Buffer [E-CK-A107],重悬细胞。

2. 调整仪器参数,上机检测。


流式细胞表面染色步骤

流式配色基本原则

微信客服 微信客服 在线留言 TOP