小鼠调节性T细胞鉴定方案
Source: Elabscience®Published: 2022-03-22
小鼠调节性T细胞鉴定步骤
配色方案
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细胞亚群 |
种属 |
指标 |
荧光标记 |
克隆号 |
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Treg |
Mouse |
CD4 |
FITC |
GK1.5 |
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CD25 |
APC |
PC-61.5.3 |
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Foxp3 |
PE |
3G3 |
小鼠调节性T细胞鉴定所需流式抗体
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产品名称 |
荧光素 |
货号 |
规格 |
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CD4 |
FITC |
100T |
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CD25 |
APC |
20T |
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Foxp3 |
PE |
20T |
小鼠调节性T细胞鉴定所需辅助试剂
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作用 |
货号 |
名称 |
规格 |
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同型对照 |
APC Rat IgG1, κ Isotype Control |
20T |
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同型对照 |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control |
20T |
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细胞染色 缓冲液 |
Cell Staining Buffer |
100mL |
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红细胞 裂解液 |
10×ACK Lysis Buffer |
100mL |
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固定 破膜液 |
Foxp3/Transcription Factor Staining Kit |
20 Assays |
样本管设置
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目的 |
样本 |
设置 |
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调电压 |
1 |
Black（空白管） |
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调补偿 |
2 |
CD4-FITC |
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3 |
CD25-APC |
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4 |
Foxp3-PE |
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同型对照 |
5 |
CD4-FITC 、Foxp3-PE 、 APC Rat IgG1, κ Isotype Control |
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6 |
CD4-FITC 、CD25-APC、 PE Mouse IgG1, κ Isotype Control |
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Full Panel |
7 |
CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE |
一、小鼠脾细胞分离步骤：
1. 取小鼠脾脏，置于PBS中；
2. 可用注射器柱塞研磨脾脏，并通过70μm细胞过滤器过滤，收集滤液到15mL离心管；
3. 300g离心5min，弃上清，得到红色细胞沉淀；
4. 加2mL 1x 红细胞裂解液，重悬沉淀，室温下裂解2~3min，再加10mL PBS，终止裂解反应；
5. 300g离心5min，弃上清，得到白色细胞沉淀，用细胞染色缓冲液重悬细胞，并做细胞计数，调整细胞浓度为1×107/mL。
二、细胞固定破膜实验步骤：
（下面是全染管的实验步骤，空白组不加抗体，单染管只在对应步骤加对应流式抗体，同型对照组将相应的流式抗体替换成同型对照，所有组都要固定破膜）
1 .根据检测的量，稀释Foxp3检测专用的固定剂和破膜剂；
2. 取100μL小鼠脾脏细胞（1×106个细胞），置于流式管内，加入1Test的FITC Anti-Mouse CD4（E-AB-F1097C）和1Test的APC Anti-Mouse CD25（E-AB-F1102E）混匀，4℃孵育30min；
3. 孵育完毕后，加入1mL细胞染色缓冲液，300g离心5min，弃上清，再加入100μL细胞染色缓冲液，重悬细胞；
4. 加入1mL固定剂，涡旋混匀，4℃反应30min；反应完成后，600g离心5min，弃上清；
5. 加入2mL破膜剂，涡旋混匀，600g离心5min，弃上清；
6. 重复步骤 5；
7. 加入100μL破膜剂，重悬细胞，再加入PE Anti-Mouse Foxp3（E-AB-F1238D），混匀后室温孵育30min；
8. 加入2mL破膜剂，600g离心5min，弃上清；
9. 加入200μL细胞染色缓冲液，重悬细胞，即可上机检测。
实验结果
小鼠脾脏Treg细胞表型分析
解析：
▶ 荧光素间有溢漏，故需要设置单阳管，用于调节补偿；
▶ CD4分群明显，无需同型对照；CD25和Foxp3分群不明显，需同型对照；
▶ 本实验取正常小鼠脾脏验证，无生物学对照；
▶ 圈门路径：
首先，根据FSC-A和SSC-A圈中目的细胞；
其次，利用光散射特性，去黏连，得到单细胞；
再次，通过CD4，确定CD4+辅助T细胞；
最后，通过CD25+/Foxp3+，确定出Treg细胞亚群。
