人外周血调节性T细胞鉴定方案
Source: Elabscience®Published: 2022-04-07
CD127 VS Foxp3
虽然Foxp3是目前公认的调节性T细胞最特异的指标，但因其位于细胞内，使得Foxp3的染色必须要固定细胞并破核膜，因此这种方法并不适用于分离活的Tregs，且该方法比较传统，操作相对复杂，稍有不慎就会影响实验结果。
而CD127属于细胞表面Marker，无需固定破膜。因此，当前主流方向是通过CD127来检测人Tregs。
CD127的发现
CD127是2006年被发现的一种检测CD4+CD25+调节性T细胞的新指标。由于不需要将细胞固定破膜处理，检测起来要比Foxp3方便。
研究发现，CD4+CD25+纯化的细胞中，CD127与Foxp3的表达呈负相关。通过CD4+CD127low纯化出的CD4+CD25+ T细胞，与Foxp3纯化的CD4+CD25+ T细胞数量相似，并且这部分细胞展现了CD4+CD25+调节性T细胞的典型特征。CD4+CD25+CD127-/low是较CD4+CD25+Foxp3+更优的特异性检测Tregs的表面标记分子。
配色方案
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细胞亚群 |
种属 |
指标 | 荧光标记 | 克隆号 |
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Treg |
Human |
CD45 |
Elab Fluor® Violet 450 |
HI30 |
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CD3 |
Elab Fluor® Red 780 |
OKT3 |
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CD4 |
FITC |
RPA-T4 |
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CD8a |
PerCP/Cyanine5.5 |
OKT-8 |
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CD25 |
PE |
BC96 |
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CD127 |
Elab Fluor® 647 |
A019D5 |
人Treg鉴定所需流式抗体
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产品名称 |
荧光素 |
货号 | 规格 |
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Elab Fluor® Violet 450 |
20T |
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Elab Fluor® Red 780 |
20T |
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FITC |
20T |
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PerCP/Cyanine5.5 |
20T |
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PE |
20T |
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Elab Fluor® 647 |
20T |
人Treg鉴定所需辅助试剂
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作用 |
货号 |
名称 | 规格 |
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Cell Staining Buffer |
100mL |
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10×ACK Lysis Buffer |
100mL |
样本管设置
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目的 |
样本 |
设置 |
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调电压 |
1 |
Blank（空白管） |
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调补偿 |
2 |
CD45-Elab Fluor® Violet 450 |
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3 |
CD3-Elab Fluor® Red 780 |
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4 |
CD4-FITC |
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5 |
CD8a-PerCP/Cyanine5.5 |
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6 |
CD25-PE |
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7 |
CD127-Elab Fluor® 647 |
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Full Panel |
8 |
CD45-Elab Fluor® Violet 450、CD3-Elab Fluor® Red 780、CD4-FITC、CD8a-PerCP/Cyanine5.5、CD25-PE、CD127-Elab Fluor® 647 |
实验步骤
01. 在离心管内加入100μL新鲜血，与2mL 1×ACK红细胞裂解液混匀，4℃裂解10min；
02. 300g离心5min（裂解完立即离心，防止时间过长损伤细胞），弃掉上清，用移液枪轻轻吸走残液，可以得到白色的细胞沉淀；
03. 加入100μL细胞染色缓冲液，重悬细胞，与流式抗体混匀，4℃孵育30min；
04. 加入2mL细胞染色缓冲液，300g离心5min，弃掉上清，再加入200μL细胞染色缓冲液，重悬细胞；
05. 上机进行检测。
实验结果
人外周血Treg细胞表型分析
解析：
▶ 荧光素间有溢漏，故需要设置单阳管，用于调节补偿；
▶ 本实验取正常人外周血验证，无生物学对照；
▶ 增加CD45指标，便于淋巴细胞圈门；
▶ 圈门路径：
第一步，根据CD45和SSC-H，圈出淋巴细胞群；
第二步，利用FSC-H和SSC-H，去黏连，得到单细胞；
第三步，通过CD3，确定CD3+ T细胞；
第四步，通过CD4和CD8，得到CD4+辅助T细胞；
第五步，通过CD25+CD127-/low，确定出Treg细胞亚群。
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