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流式细胞表面染色步骤

流式细胞表面染色步骤

2018-08-01作者:admin赞:7

1. 样本准备(详见流式细胞术样本制备技术


1)采集全血或组织(脾,淋巴结,胸腺和骨髓),用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。对于体外刺激的细胞,直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中,然后进行第2)步。


2)加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。


2. 红细胞裂解


1)如需裂解红细胞(如脾脏,骨髓等),将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x,放置到室温。将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中,室温孵育3-5分钟;如不需要裂解红细胞(如胸腺和淋巴结等),直接进入第3)步。


2)  加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解,300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。


3)  加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。


4)  细胞计数,用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。将100μL细胞悬液加入流式管中备用。


3. 封闭Fc受体


封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。


小鼠中,纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合,封闭非特异性染色,使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体,室温孵育10分钟。


对于人和大鼠,可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断,或者用商业化的Fc受体阻断剂。


4. 细胞染色


1)  按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体,混匀后置于4℃,避光孵育30分钟。


2) 加入5 mL细胞染色buffer (或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞,300g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清。


3)  加入0.5 mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞,用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项:


1. 使用前请将粘附于管壁和管盖的抗体离心下来;


2.       抗原抗体结合动力学与温度有关,冰上孵育需适当延长孵育时间;


3.       部分抗体可能需要依据说明书标注的非标准培养条件孵育;


4.       固定或延迟分析可能会减弱荧光信号。为了获得较好的效果,染色后尽量立即进行分析。



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