流式细胞表面染色步骤

一、样本准备

详见流式细胞术样本制备技术

1. 收集细胞，200目筛网过滤，收集滤液，300 g离心5 min，弃上清

2. 向细胞中加入适量细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)，用移液枪轻轻吹打细胞重悬

二、细胞计数

用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后，调整细胞浓度约为1 × 10⁷/mL

三、设置实验分组

四、封闭Fc受体

封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

对于小鼠样本，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5~1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体（E-AB-F0997A），室温孵育10分钟。

对于大鼠样本，可使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。

对于人样本，纯化的CD16单抗可作为封闭FCR封闭剂。加1 μg纯的抗人CD16单克隆抗体（E-AB-F1236A），室温孵育10 min。

五、细胞染色

1. 按照说明书的推荐用量加入荧光标记抗体，混匀后置于4℃，避光孵育30分钟。

2. 加入细胞染色buffer (或含1%BSA的PBS)重悬细胞，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

3. 加入200μL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。