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流式配色原则总结篇

Source: Elabscience®Published: 2024-06-06

前几期我们详细介绍了多色流式配色的原则,今天再一起总结回顾吧。

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流式配色原则(一)——强弱搭配,即弱表达抗原搭配强荧光染料,强表达抗原搭配弱荧光染料。搭配时要注意,抗原密度一定是在细胞亚群水平上确定的,抗原密度也会由于激活状态而有所改变。Marker的表达量可以参考相关资料或者文献来确定,荧光染料的强弱可以参考下表,或者通过染色指数判断。

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图1. 荧光素种类

流式配色原则(二)——弱表达抗原放在无干扰通道,强表达抗原放在不干扰其它通道的通道。无干扰通道意味着其它通道不会对该通道造成干扰,如FITC通道。以人外周血多色检测为例,人外周血样本中CD45的表达量非常高,容易影响弱表达抗原的检测。此时,我们可以给CD45搭配一个不干扰其他通道的荧光素,如Elab Fluor® Violet 450 (Pacific Blue通道),这样就不会对488 nm或者633 nm激光器激发的染料产生干扰。

为什么要避免荧光干扰呢?这是因为通过调节补偿仅能消除荧光背景,而被干扰通道的荧光灵敏度降低无法通过调节补偿恢复。因此,在配色时应尽可能地规避荧光间的相互干扰,才能得到更准确的结果。

无干扰↓

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干扰严重↓

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图2. 荧光干扰的影响

流式配色原则(三)——互相排斥的抗原允许荧光溢漏。配色时,要注意抗原之间的相互关系。如果抗原间存在互斥关系,那么可以使用高干扰的荧光组合。抗原间的互斥关系,是指两种抗原不会同时表达在一种细胞上,比如CD3+T细胞中有一群细胞表达CD4,不表达CD8,那么CD4和CD8就属于互斥抗原。此时,CD4和CD8可以分别搭配FITC和PE这两个有明显干扰的荧光染料。

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图3. CD4和CD8为互相排斥抗原

流式配色原则(四)——共表达抗原要避免荧光溢漏,即抗原之间是共表达关系,则可以搭配没有相互干扰的荧光染料。以Treg细胞为例,Treg细胞同时表达CD25和Foxp3的, CD25和Foxp3就属于共表达关系。在流式图上我们要分析的是双阳性细胞的比例,所以CD25和Foxp3可以分别搭配APC和PE这两个几乎没有干扰的荧光染料。

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图4. Treg中CD25和Foxp3为共表达抗原

流式配色原则(五)——如果抗原之间是子代与亲代的关系,那么允许子代对亲代有荧光溢漏,同时避免亲代对子代的溢漏。以CD4+T细胞为例,因为CD4+T细胞都表达CD3 ,所以CD3作为亲代可以搭配FITC,CD4作为子代可搭配PE。此时,CD4处于没有干扰的通道,容易进行补偿调节,有利于数据的分析。

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图5. CD3-FITC与CD4-PE双染结果

配色的原则有这么多,大家配色的时候会发现,我们很多时候并不能完全满足这其中的每一条。我们只能尽量通过这些原则,使数据分析的复杂程度降到最低

我们在配色的时候有一句话是这样说的:没有最好,只有更好,配色方案的优化是一个灵活的过程。Elabscience®流式抗体多达14种荧光标记,适用于更多实验方案,提供免费配色和数据分析服务,提供整体流式解决方案。

往期回顾:

流式课堂 | 流式配色原则第一课:强弱搭配

流式课堂 | 流式配色原则第二课:荧光干扰

流式课堂 | 流式配色原则第三课:互斥抗原

流式课堂 | 流式配色原则第四课:共表达抗原

流式课堂 | 流式配色原则第五课:子代与亲代


流式配色原则第五课:子代与亲代

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