流式配色原则总结篇

前几期我们详细介绍了流式配色原则，今天再一起总结回顾吧。

流式配色原则（一）—强弱搭配，即弱表达抗原搭配强荧光染料，强表达抗原搭配弱荧光染料。搭配时要注意，抗原密度一定是在细胞亚群水平上确定的，抗原密度也会由于激活状态而有所改变。Marker的表达量可以参考相关资料或者文献来确定，荧光染料的强弱可以参考下表，或者通过染色指数判断。

图1. 荧光素种类

流式配色原则（二）—荧光干扰：弱表达抗原放在无干扰通道，强表达抗原放在不干扰其它通道的通道。无干扰通道意味着其它通道不会对该通道造成干扰，如FITC通道。以人外周血多色检测为例，人外周血样本中CD45的表达量非常高，容易影响弱表达抗原的检测。此时，我们可以给CD45搭配一个不干扰其他通道的荧光素，如Elab Fluor^® Violet 450 （Pacific Blue通道），这样就不会对488 nm或者633 nm激光器激发的染料产生干扰。

为什么要避免荧光干扰呢？这是因为通过调节补偿仅能消除荧光背景，而被干扰通道的荧光灵敏度降低无法通过调节补偿恢复。因此，在配色时应尽可能地规避荧光间的相互干扰，才能得到更准确的结果。

图2. 荧光干扰的影响

流式配色原则（三）—互斥抗原：互相排斥的抗原允许荧光溢漏。配色时，要注意抗原之间的相互关系，如果抗原间存在互斥关系，那么可以使用高干扰的荧光组合。抗原间的互斥关系，是指两种抗原不会同时表达在一种细胞上，比如CD3⁺T细胞中有一群细胞表达CD4，不表达CD8，那么CD4和CD8就属于互斥抗原。此时，CD4和CD8可以分别搭配FITC和PE这两个有明显干扰的荧光染料。

图3. CD4和CD8为互相排斥抗原

流式配色原则（四）—共表达抗原：共表达抗原要避免荧光溢漏，即抗原之间是共表达关系，则可以搭配没有相互干扰的荧光染料。以Treg细胞为例，Treg细胞同时表达CD25和Foxp3的， CD25和Foxp3就属于共表达关系。在流式图上我们要分析的是双阳性细胞的比例，所以CD25和Foxp3可以分别搭配APC和PE这两个几乎没有干扰的荧光染料。

图4. Treg中CD25和Foxp3为共表达抗原

流式配色原则（五）—子代与亲代：如果抗原之间是子代与亲代的关系，那么允许子代对亲代有荧光溢漏，同时避免亲代对子代的溢漏。以CD4⁺T细胞为例，因为CD4⁺T细胞都表达CD3 ，所以CD3作为亲代可以搭配FITC，CD4作为子代可搭配PE。此时，CD4处于没有干扰的通道，容易进行补偿调节，有利于数据的分析。

图5. CD3-FITC与CD4-PE双染结果

配色的原则有这么多，大家配色的时候会发现，我们很多时候并不能完全满足这其中的每一条。我们只能尽量通过这些原则，使数据分析的复杂程度降到最低。

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